《RSC Chemical Biology》：Enabling the synthesis of multi-payload thio-antibody conjugates through the use of pyridazinediones, p-anisidine derivatives and various click chemistries
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编者荐语
抗体药物偶联物（ADC）是靶向治疗的重要类别，但其优化仍面临剂量限制性毒性与耐药性等挑战。本综述提出了一种基于吡啶二酮（diBrPDs）、对甲氧基苯胺衍生物及点击化学的平台技术，实现了对硫代抗体（thio-antibodies）进行位点选择性、模块化的修饰，可精确合成有效载荷与抗体比率（PAR）为1至8的偶联物，并能同时装载最多三种不同的有效载荷（如荧光基团）。该平台为下一代多药物、可控负载的ADC开发提供了灵活通用的合成策略。
文章内容归纳总结
引言
在过去的几十年中，抗体药物偶联物（ADC）已成为一类重要的靶向治疗药物。尽管已有15种ADC获得FDA批准，但临床试验失败率仍然很高，ADC候选药物常受到脱靶毒性和耐药性等问题的困扰。目前已批准ADC均使用经典的赖氨酸或半胱氨酸偶联方法，这些方法常导致产物异质性。相比之下，均一且位点选择性的ADC被广泛认为在疗效和安全性方面更具优势。此外，对于特定ADC而言，最佳药物抗体比率（DAR）可能因药物、抗体和靶点组合而异。近年来，使用承载多种药物的ADC来抵消耐药性引起了广泛关注。因此，能够模块化构建具有不同DAR或药物类别的ADC技术变得至关重要。
位点选择性抗体修饰策略通常针对天然抗体或工程化抗体设计。其中，含有工程化半胱氨酸的抗体（即硫代抗体，如THIOMABs?）是制备ADC的重要支架。它们能通过马来酰亚胺选择性反应形成DAR为2的均一偶联物，且已被证明比非位点特异性偶联物更安全有效。然而，由于抗体的对称性，通常难以从硫代抗体获得奇数的药物负载，且在不进行进一步工程化或使用高度复杂连接子的情况下，很难制备多药物负载的硫代抗体。另一方面，用于天然抗体的位点选择性偶联方法包括二硫键重桥连等。近年来，二溴吡啶二酮（diBrPDs）类试剂在此领域得到了广泛探索，可用于形成（近乎）均一的DAR 2/4/8 ADC。
结果与讨论
本研究开发了一个平台，用于硫代曲妥珠单抗突变体（thio-trastuzumab mutants）的模块化、位点选择性合成，能够获得有效载荷与抗体比率（PAR）为1、2、3、4、5、6、7和8的精确偶联物。该平台的核心是基于仅使用三种关键分子：带有张力炔烃（BCN）的二溴吡啶二酮（BCN PD 1）、叠氮功能化的双吡啶二酮（ArN3bisPD 2）和功能化的叠氮苯胺（N3aniline 3）。结合可点击的有效载荷（clickable payloads），该策略能够合成PAR 1-8的全系列产物，并实现在硫代曲妥珠单抗突变体上以不同比例附加最多三种不同的有效载荷。通过改变所使用的试剂和/或试剂与各种可点击有效载荷试剂的组合顺序，可以调节不同的PAR和有效载荷比例。
PARs 2, 4 和 2 + 2
研究首先将去封端的硫代曲妥珠单抗突变体LC S168C 8和HC S378C 7与BCN PD 1反应，成功形成了共轭物9和10。随后，通过点击化学将Azide-Fluor 488连接到这些共轭物上，得到HC S378C-Azide Fluor 488 11和LC S168C-Azide Fluor 488 12。接着，用N3aniline 3置换剩余的溴原子，得到共轭物13和14。这些共轭物可以再次通过点击反应连接张力炔烃承载的有效载荷，从而获得PAR 4（如果点击相同有效载荷）或2 + 2（如果点击不同有效载荷）的偶联物，例如使用BP-Fluor 568处理LC S168C突变体得到共轭物15。
PARs 1, 3 和 1 + 2
研究假设，如果两个突变半胱氨酸在空间上足够接近，双二溴吡啶二酮（bisDiBrPDs）可以跨越它们发生反应。分子建模显示，HC S378C突变体上两个重链突变半胱氨酸之间的距离约为22.5 ?，与ArN3bisPD 2的反应位点距离（约22.5 ?）匹配，而轻链突变体的距离则远得多（约87.1 ?）。实验证实，ArN3bisPD 2能够与HC S378C突变体7成功反应，形成共轭物16。通过点击反应连接BP-Fluor 568 DBCO即可获得均一的PAR 1共轭物17。先用N3aniline 3置换溴原子，再点击BP Fluor 647 DBCO，则可获得PAR 1 + 2（或3）的共轭物19。
曲妥珠单抗的二硫键重桥连
在进一步处理硫代抗体之前，研究首先在天然曲妥珠单抗上建立了使用BCN PD 1和ArN3bisPD 2进行二硫键重桥连的稳健方案。优化后的方案能产生近乎均一的共轭物：使用BCN PD时获得PD-抗体比率（PDAR）4；使用ArN3bisPD时获得PDAR 2。这些共轭物随后可被完全点击（例如分别与Azide-fluor 488和DBCO-biotin反应）。
硫代抗体二硫键与突变半胱氨酸的同时反应：PARs 6, 8 和 6 + 2
研究探索了一种一锅法策略，即在还原硫代抗体后，直接加入二溴吡啶二酮，使其同时与突变半胱氨酸以及还原后的天然链间二硫键反应。这种方法成功应用于已去封端的HC S378C突变体7和半胱氨酸封端的LC S168C突变体6，分别形成了PDAR 6共轭物22和26。这些共轭物随后可通过点击有效载荷（如Azide-fluor 488）和/或与对甲氧基苯胺（p-anisidine）或N3aniline 3反应，进一步获得PAR 8（6 + 2）的共轭物（如24和29），实现了PAR 6、8和6 + 2的概念验证。
突变半胱氨酸修饰的硫代抗体共轭物的二硫键重桥连
为了合成三功能的硫代曲妥珠单抗-PD共轭物，并获取PAR 5和7，需要确保PD修饰的突变半胱氨酸在TCEP还原条件下稳定。稳定性测试证实，硫代氨基PD（thioaminoPD）连接在所需的二硫键还原条件下是稳定的。基于此，研究对预先在突变位点修饰了PD和有效载荷的共轭物进行了二硫键重桥连。
PAR 6: 2 + 4 的概念验证
研究合成了LC S168C-BCN PD-p-anisidine–Azide Fluor 488共轭物30，然后对其天然二硫键进行还原，并用BCN PD 1重桥连，得到重桥连共轭物31。随后点击Azide-fluor 488，成功获得了洁净的共轭物32，为两步法反应以及PAR 6和2 + 4提供了概念验证。
PAR 6: 2 + 2 + 2
接下来，研究用ArN3bisPD 2对共轭物15（LC S168C上的BCN PD已连接Azide-fluor 488和BP Fluor 568）的天然二硫键进行重桥连，形成共轭物33。随后点击BP Fluor 647，得到共轭物34，从而实现了2 + 2 + 2（PAR 6）的合成。
PAR 5: 2 + 1 + 2
为了合成PAR 5共轭物，研究将共轭物20（HC S378C上的ArN3bisPD已连接DBCO biotin和BP Fluor 568）的天然二硫键还原，并用ArN3bisPD 2重桥连，形成共轭物35。点击BP Fluor 647后，得到共轭物36，从而实现了2 + 1 + 2（PAR 5）的合成。
PAR 7: 2 + 1 + 4
最后，研究将共轭物19（HC S378C上的ArN3bisPD已连接BP Fluor 568和BP Fluor 647）的天然二硫键还原，并用BCN PD 1重桥连，形成共轭物37。点击Azide-Fluor 488后，得到三功能共轭物38，从而实现了2 + 1 + 4（PAR 7）的合成。至此，研究成功获得了PAR 1至8的全系列硫代抗体共轭物。
ELISA与内化研究
在成功合成系列共轭物后，研究通过ELISA评估了关键代表性子PDAR 6 LC S168C共轭物和HC S378C共轭物16与HER2抗原的结合能力。结果显示，这些共轭物与未修饰的硫代曲妥珠单抗对照相比，在HER2结合方面没有显著差异，表明偶联策略未损害抗体-抗原结合。
最后，研究对选定的三功能共轭物（LC S168C共轭物34和HC S378C共轭物38）进行了内化研究。使用HER2+的BT-474细胞系和HER2?的MCF-7对照细胞系。实验表明，共轭物34和38仅与HER2+细胞结合并被内化。在4°C结合1小时后，荧光信号聚集在HER2+细胞膜周围；在37°C孵育20小时后，荧光信号主要集中在细胞内的点状结构中，表明有效载荷被内化到细胞区室中。三种荧光基团（Azide-fluor 488、BP Fluor 568和BP Fluor 647）均被检测到，并在细胞内呈现相似的分布模式，证实了所有三种有效载荷都成功地被递送到靶细胞中。
结论
本研究披露了一个用于模块化、位点选择性构建硫代曲妥珠单抗突变体共轭物的平台，可实现PAR 1至8的精确合成。仅使用BCN PD 1、ArN3bisPD 2和N3aniline 3，结合各种可点击有效载荷，即可实现所有目标PAR，并能附加最多三种不同的有效载荷。该化学方法的模块性以及多种化学选择性反应的利用，使得以简便的方式实现不同类别有效载荷的各种比例成为可能。ELISA证明了关键代表性子共轭物保留了与HER2的结合能力，三有效载荷负载的硫代抗体共轭物能够选择性地内化到HER2+细胞中，并将所有有效载荷成功递送至靶细胞。总体而言，该平台为简易合成具有1至8 PAR的多有效载荷硫代抗体共轭物提供了可行方案。
