《RSC Chemical Biology》：Tuning potency for precision: the role of the G4-ligand in G4-ligand conjugated oligonucleotides targeting individual G-quadruplex DNA structures
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本文介绍了一项关于G-四链体（G4）DNA靶向治疗策略的研究。G4结构广泛存在于基因调控区（如癌基因），影响细胞功能。传统的小分子G4-配体（G4-ligand）存在选择性不足的挑战。为了解决这一问题，研究者开发了G4-配体共轭寡核苷酸（GL-O），通过一个向导寡核苷酸（oligonucleotide）将配体特异性地递送至目标G4结构附近的侧翼序列。本研究聚焦于探索不同G4-配体（如Phen-DC3、Pyridostatin）的物理化学性质（如尺寸、电荷）如何影响GL-O对特定G4（如c-MYC Pu24T）的结合力、稳定效力及特异性。结果表明，更强效的配体（更大、带正电）能增强GL-O的结合与稳定能力，但也可能增加脱靶风险。这强调了在设计GL-O时，需要精细平衡配体的效力，以实现对单个G4结构的高精度靶向。这项工作为研究单个G4的生物学功能及开发精准治疗药物提供了新策略。
引言
G-四链体（G4）DNA是一种由富含鸟嘌呤（G）的序列形成的非B型DNA二级结构，其稳定性依赖于Hoogsteen氢键、芳环-芳环堆积作用及阳离子（如K+）的配位。G4广泛存在于人类基因组的调控区域，如端粒、复制起点和癌基因（例如c-MYC、c-KIT）的启动子区，被认为在细胞功能（包括基因表达调控）中扮演关键角色。尤其重要的是，大约70%的人类癌症中存在癌基因c-MYC的失调，其上游启动子区包含一个能形成名为Pu27的G4结构的G富集区。能够结合并稳定该G4的小分子（即G4-配体），可以抑制c-MYC的表达，从而成为潜在的癌症治疗策略。
然而，目前已发现超过一千种G4-配体，尽管它们能有效区分双链DNA（dsDNA）和G4 DNA，但普遍缺乏在不同G4结构（即“G4间选择性”）之间进行区分的能力。这限制了它们作为研究工具或治疗药物的进一步发展。
G4-配体共轭寡核苷酸（GL-O）策略
为了克服选择性难题，研究者开发了G4-配体共轭寡核苷酸（GL-O）策略。该策略的核心是将一个G4特异性配体连接到一个短的DNA片段（寡核苷酸）上，这个寡核苷酸被设计成与目标G4结构侧翼的序列互补，从而作为“向导”，将G4-配体精准地引导至并结合到目标G4结构上，同时最小化与非匹配G4的相互作用。连接寡核苷酸和配体的连接子长度可以调节，以适应向导序列与G4核心之间的不同距离。然而，GL-O策略的关键组成部分是诱导G4稳定的G4-配体本身。
研究设计与合成
本研究旨在探究G4-配体的选择如何影响GL-O的整体效能。为此，研究人员设计并合成了一系列具有不同化学特性的G4-配体，并将其共轭到相同的向导寡核苷酸上，构建了新的GL-O分子（标记为GL-O 1至9）。这些配体涵盖了三大类：
- 1.
具有类药特性的配体：如基于喹唑啉和喹喔啉-嘧啶支架的配体（GL1-3），它们分子量小、无永久电荷，其中GL1和GL2是高效的G4稳定剂，而GL3活性很弱。
- 2.
新型高效配体：如吡啶双喹唑啉配体（GL4和GL5），它们具有C2对称性，且无永久电荷，表现出强效的G4稳定活性。
- 3.
已知的参照配体：包括Phen-DC3、Pyridostatin和TMPyP4，它们是G4研究领域的经典参照物，其中Phen-DC3和TMPyP4带有永久正电荷。
所有配体均被功能化，末端带有叠氮基团，以便通过应变促进的叠氮-炔环加成反应（SPAAC）与带有环辛炔修饰的寡核苷酸进行共轭。此外，还合成了一个不含G4结合功能的苄基对照分子（GL-O9）。
GL-O的结合特性分析
研究首先评估了这些GL-O分子对其目标G4 DNA（即c-MYC Pu24T，包含其15个核苷酸的5‘端侧翼序列）的结合亲和力。
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微尺度热泳分析：结果显示，大多数GL-O（1-7和9）都能有效地与目标G4 DNA结合，解离常数（KD）值在9至23 nM之间。相比之下，含有TMPyP4类似物的GL-O8结合非常弱（KD> 100 nM）。单独的G4-配体（未与寡核苷酸共轭）的结合亲和力则普遍较差，这凸显了与寡核苷酸共轭后带来的结合力增强效应，这既归因于溶解度的显著改善，也归功于向导寡核苷酸提供的额外Watson-Crick碱基配对作用。
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核磁共振氢谱分析：通过监测亚氨基质子信号（10-12 ppm对应G4，12-14 ppm对应dsDNA），可以同时评估G4-配体与G4的相互作用以及寡核苷酸的杂交情况。结果显示，GL-O1至7和9成功与侧翼序列杂交，形成了双链DNA信号。而GL-O8几乎不显示双链DNA信号，且其G4区域的信号谱图与阴性对照相似，表明它未能有效杂交并与G4相互作用。这可能是因为TMPyP4已知也能与单链DNA结合，导致其与自身连接的寡核苷酸发生分子内或分子间相互作用，从而抑制了与目标序列的杂交。对于高效的配体（如GL-O6，基于Phen-DC3），单独使用时会引起G4亚氨基质子信号的广泛位移，而共轭成GL-O后，这些位移显著减小，这表明GL-O共轭阻止了非特异性结合，迫使配体在特定区域结合。
GL-O的稳定化能力评估
研究人员进一步评估了GL-O对G4 DNA的热稳定化效应。
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核磁共振热熔解分析：通过逐步升温（从45°C到65°C）并监测亚氨基质子信号的变化，发现G4的亚氨基质子信号在整个测试温度范围内相对稳定，而指示杂交状态的双链DNA信号对热扰动更敏感。含有弱配体（GL-O3）的GL-O，其双链DNA信号可维持到55°C，比苄基对照（GL-O9，50°C完全熔解）提高了5°C。含有更强效配体（如GL-O1，2，4-7）的GL-O，则能提供更高效的双链稳定，完全熔解温度可达60-65°C。值得注意的是，最强效的配体（如GL-O5和GL-O7）甚至在双链熔解后仍能保持与G4的结合特征，这意味着这些配体可以在不依赖于寡核苷酸杂交的情况下独立维持G4相互作用。
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DNA聚合酶终止试验：在更接近生物学条件的实验中，利用Taq聚合酶延伸含有Pu24T G4结构的DNA模板。G4结构本身会阻碍聚合酶前进，导致延伸产物变短（“终止”）。有效的GL-O能进一步稳定G4，从而增强聚合酶的终止效应，减少全长DNA产物的生成。结果显示，除GL-O8外，所有测试的GL-O（1-8）都表现出剂量依赖性的G4稳定作用，导致全长产物显著减少。在低浓度下，除GL-O8外，其他GL-O的稳定效果相当；但在较高浓度下，含有弱配体GL3的GL-O3稳定效果明显低于其他GL-O。对照GL-O9仅因寡核苷酸杂交引起适度的终止效应，但并未表现出G4特异性稳定。
探索GL-O的潜在脱靶结合
由于最强效的GL-O（如GL-O5-7）中的配体可能在寡核苷酸解离后仍保持G4结合，这引发了其对非互补G4结构产生脱靶结合和稳定的担忧。为了评估这种可能性，研究者测试了GL-O与不同非靶标G4结构的结合：
- 1.
不含互补侧翼序列的c-MYC Pu24T G4：GL-O1-3以及对照GL-O9均未检测到结合。而GL-O4-8则表现出不同程度的结合亲和力，但这与其单独G4-配体的效力相关，且亲和力比存在互补杂交时低约1000倍。
- 2.
具有非互补侧翼序列的c-MYC Pu27 G4：所有测试的GL-O（1-8）都表现出结合，但强效配体GL-O6和7的KD值反而高于较弱效的GL-O1-3。
- 3.
另一种平行拓扑的G4结构（Helicase B G4–1）：无论有无侧翼序列，趋势类似，效力较弱的GL-O3结合很弱或无法检测到，而效力更强的GL-O表现出一定结合。
综合这些数据表明，当缺乏向导寡核苷酸的杂交时，含有更强效、更“通用”的G4-配体的GL-O确实能够与非靶标G4结合。然而，这种非特异性相互作用仅发生在远高于其与正确靶标（当配体和寡核苷酸协同作用时）结合的纳摩尔级亲和力所需的浓度下。此外，这种行为并非普遍存在，例如GL-O7对c-Kit 2 G4的结合就非常微弱。
结论
G4-配体是GL-O策略的核心组件，它直接调控G4结构的稳定化，而共轭的寡核苷酸则确保配体被精确递送至预定目标。本研究通过设计一系列包含不同化学特性G4-配体的新型GL-O共轭物，系统评估了配体在GL-O结合、相互作用和稳定化能力中的关键作用。
研究发现，将G4-配体共轭到寡核苷酸上会显著改变其物理化学性质（如分子量、溶解度），并且向导寡核苷酸能将配体精准定位到目标G4结合位点附近。更强效的配体（通常更大、有时带永久正电荷，如GL-O5-7）得益于共轭带来的溶解度改善，表现出强大的结合和显著的稳定能力。相反，化学结构相似但活性很弱的配体（如GL-O3中的GL3），尽管能被正确定位并显示出与G4的相互作用，但其固有的弱稳定能力并未因正确定位而得到实质性增强。并非所有已知的G4-配体都适合转化为高效的GL-O，例如基于TMPyP4的GL-O8在1:1摩尔比下就未能成功杂交并与G4相互作用。
重要的是，研究揭示了一个潜在的权衡：最强效配体构成的GL-O，其配体可能在寡核苷酸解离后仍保持G4结合，这暗示了脱靶风险。通过与非靶标G4的结合实验证实，这种脱靶结合是可能的，但其选择性窗口很大（即使对最强效配体，所需浓度也高出100-1000倍）。通过选择不同类型的配体（例如更小、更具类药特性的配体），可以调控甚至避免这种脱靶效应。
总之，本研究深入揭示了GL-O框架内G4-配体与G4结构相互作用的细节，强调了配体在探索不同G4 DNA靶标中的核心作用。通过精细调整GL-O策略中的G4-配体，该方法不仅为研究单个G4结构的生物学功能（当前该领域缺乏此能力）开辟了道路，也为将其发展为未来的治疗模式奠定了基础。
