《Journal of Equine Veterinary Science》：Confocal laser endomicroscopy: exploring endometrial image quality in relation to the oestrous cycle of mares
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本研究通过对比母马发情周期中Confocal激光显微内窥镜（CLE）图像质量，发现静期图像质量评分（2.67）高于发情期（2.47），且图像质量与水肿评分呈负相关（p<0.001）。建议在无显著水肿的静期进行CLE检查以提高诊断准确性。
K. Gallacher|L. Woolford|R.O. Gilbert|L.C. Santos|J. McLeod|M. Hebart|G. Ferlini Agne|S. du Preez|K.L. Kind
阿德莱德大学动物与兽医科学学院，南澳大利亚州罗斯沃西，5371
摘要
背景
评估子宫内膜是母马繁殖健康检查的重要组成部分。目前评估马子宫内膜健康的参考标准是对子宫内膜活检进行组织病理学评估，然而，当仅使用一次盲法活检时可能会出现不一致性。共聚焦激光内镜检查（CLE）是一种无创技术，能够实时成像子宫腔内多个位置的子宫内膜。初步研究表明，不同母马之间的CLE图像质量存在差异。
目的
本研究旨在比较母马发情周期中子宫内膜CLE图像的质量。
方法
24匹母马分别在第14天和第21天接受了两次CLE检查。研究人员制定了一个4分级的图像评分标准，并由四位盲法评估者对图像进行评分。使用组内相关性（ICC）评估评分者之间的一致性。结果显示：使用双向随机效应模型和平均评分者时，一致性为中等（ICC(C,4) = 0.702，p = 9.3 × 10???）。研究了图像深度和周期阶段对图像质量的影响。在腔上皮层采集的图像质量低于在黏膜下层采集的图像（分别为2.46 vs 2.68，p<0.001），以及发情期采集的图像质量低于第14天采集的图像（分别为2.47 vs 2.67，p<0.001）。图像质量评分与水肿评分呈负相关（p=0.0002）。
结论
子宫CLE图像的质量受发情周期阶段的影响，建议在子宫内膜水肿最轻微时进行CLE检查。
引言
为了使马匹繁殖产业取得成功，繁殖母马需要具备较高的生产力，并能够产下存活且健康的幼驹[1]。健康的子宫环境是这一过程的关键因素，因此准确的诊断、管理和治疗策略都有助于降低繁殖效率。研究表明，不孕母马中子宫内膜炎的发病率很高[2,3]。子宫内膜炎症可能导致受精失败、早期胚胎死亡和黄体期缩短[4,5]。子宫内膜炎可分为临床型和亚临床型，多达四分之一的母马在繁殖前可能患有亚临床子宫内膜炎但未被发现[6]。尽管子宫内膜炎在母马中较为常见，但确定其确切诊断仍具有挑战性[7,8]。目前评估马子宫内膜健康的参考标准是对子宫内膜活检进行组织病理学评估。Kenney-Doig分类量表被广泛使用，其评分标准利用分级系统来评估子宫内膜内的炎症和纤维化变化[9]。然而，依赖子宫内膜活检结果作为评估子宫内膜健康的参考标准受到质疑[10]。文献中的证据表明，单次子宫内膜活检样本可能无法反映子宫的整体健康状况[11],[12],[13]。共聚焦激光内镜检查（CLE）是一种用于活体组织显微评估的内镜技术，十多年前已应用于人类医学[14,15]，随后逐渐用于评估与炎症相关的显微异常[16],[17],[18]。该技术已获得美国胃肠内镜学会的认可[19]，并且证明是安全的（不会加热组织，荧光剂荧光素钠也是FDA批准的药物，具有良好的安全性[20]。CLE成像系统可以是基于探针的（pCLE），即通过内镜的活检通道推进激光探针以接触待成像组织[21]，也可以是完全内镜整合的（eCLE）系统，激光探针在远端进行接触和成像，同时保持活检通道可用[14]。
共聚焦显微镜的成像深度取决于组织和使用的荧光剂协议。共聚焦图像的形成依赖于将紧密聚焦的激光束投射到组织中，以及发射光返回共聚焦检测孔（本例中为光纤）的过程。这一光学路径容易受到组织的光传播、吸收和散射特性的影响。在组织内增加成像深度会导致散射效应，从而降低图像分辨率和灵敏度。当成像平面深度接近实际极限（通过组织的上100-200 μm）时，会出现图像逐渐变软和变暗的现象[14,22,23]。在某些细胞核非常密集的组织中（如肠上皮），焦平面深度进一步受限，约为60 μm[14]。在我们之前的研究中，eCLE设备（Optiscan，澳大利亚）的成像平面深度可由用户调节，范围从表面到250 μm，但在成像过程中无法记录z轴上的确切深度并保存图片[24]。本研究中使用的新一代eCLE模型（ViewnVivo，Optiscan，澳大利亚）可以计算并记录组织深度，这些数据也嵌入TIFF图像文件中，从而可以评估图像深度对图像质量的影响。
我们使用CLE对母马子宫内膜组织进行成像的初步研究发现，不同母马之间的CLE图像质量存在差异[24]。假设发情期间存在的生理性子宫内膜水肿可能对图像质量产生负面影响。本研究的目的是通过比较发情期和第14天采集的图像质量，确定使用CLE评估子宫内膜组织的最佳发情周期阶段，以实现最佳图像质量和诊断效果。另一个目标是确定使用荧光素钠作为荧光剂时子宫内膜的潜在成像深度，并比较腔上皮层与黏膜下基质组织的图像质量，以评估图像深度对图像质量的影响。提高子宫成像的质量和效率将有助于我们更好地理解并诊断母马的生殖障碍，从而提出更有效的健康建议和治疗方案。
部分内容摘录
伦理批准
该研究方案获得了阿德莱德大学动物伦理委员会的批准（批准编号：S2018-109；2019年1月）。
动物
研究使用了24匹年龄在7至17岁之间的母马，中位年龄为12岁，品种多样（标准纯种马n=21，纯种马n=1，康尼马拉马n=1，骑乘用小马n=1）。这些马属于阿德莱德大学的教学和研究群体，它们的繁殖史未知，但大多数母马已被退役。
结果
从24匹母马中收集了4294张子宫内膜CLE图像，这些母马在发情周期的两个阶段接受了检查，每匹马平均保存了89.5张图像。此外还收集了821张叠加图像或多张图像，每匹马平均17张。所有四位评估者对534张图像进行了质量评分。使用双向随机效应模型计算了组内相关性系数（ICC）以评估评分者之间的一致性。
讨论
本研究的结果支持以下假设：发情期间存在的生理性子宫内膜水肿会对使用CLE收集的子宫子宫内膜图像的质量产生负面影响。与发情期相比，第14天母马发情周期的图像质量更高，且子宫水肿评分与图像质量评分呈负相关。在某些情况下，对发情且水肿评分最高的母马的腔上皮层进行成像较为困难。
结论
马子宫内膜图像的质量似乎受发情周期阶段的影响，第14天的图像质量更高。这可能指导临床医生在第14天或水肿评分不最高时进行CLE检查。在固有层与腔上皮层之间，图像质量评分更高。这些数据可能有助于规范研究程序，也有助于应用这项新技术。
出版伦理声明
我代表所有合作者证明，我们提交的文章遵循了出版伦理原则。
标题：“共聚焦激光内镜检查：探索与母马发情周期相关的子宫内膜图像质量”
所有作者同意：
本研究准确描述了所进行的工作，所有数据均准确无误，方法描述足够详细，可供他人重复实验。
本手稿代表完全原创的工作；如果包含他人工作或引用的内容，也明确了出处。
K. Gallacher：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、软件、资源管理、方法设计、研究实施、资金获取、数据分析、数据管理、概念构思。L. Woolford：撰写——审阅与编辑、验证、监督、方法设计、数据管理、概念构思。R.O. Gilbert：撰写——审阅与编辑、验证、监督、方法设计、研究实施、数据管理。L.C. Santos：撰写——审阅与
所有作者均无可能不恰当地影响或偏倚论文内容的财务或个人关系。Optiscan提供了本研究中使用的CLE设备，但未参与研究设计、数据收集与分析，也未参与决定提交论文发表。作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本研究。
致谢
初步结果已在2023年7月10-14日于巴西举行的第13届国际马匹繁殖研讨会上以摘要形式发表。本研究部分得到了Agrifutures Australia的资助（资助编号PRJ-012123）。我们感谢兽医技术人员Sharna Coleman、Melanie Kittel和Gregg McKee在协助检查项目中的母马方面所做的共同努力。
