菟丝子（Cuscutae Semen）和熟地黄（Rehmanniae Radix Preparata）在由Gad1调控引起的与年龄相关的中枢性听力损失中的治疗潜力

《Journal of Ethnopharmacology》：Therapeutic Potential of Cuscutae Semen and Rehmanniae Radix Preparata in Age-Related Central Hearing Loss Associated with Gad1 Regulation

老年性耳聋传统药方（菟丝子+熟地黄）通过恢复GABA能神经递质和调节中枢听觉增益发挥保护作用。

　　

作者名单：Youn Hee Nam、Sung Woo Shin、Na Woo Kim、Gyeong Jin Seo、Min Cheol Kim、Subha Pandian、Nevedita Murughanantham、Do Hoon Kim、Yu Hwa Park、Ha Na Hong、Min Ji Park、Kwang Won Jeong、Bin Na Hong、Tong Ho Kang

韩国京畿道龙仁市全球校区京熙大学生物技术研究生院融合生物技术及先进材料科学系，邮编17104

摘要

民族药理学意义

根据《明医别录》《本草纲目》《东医宝鉴》等经典医书记载，菟丝子（Cuscutae Semen）和熟地黄（Rehmanniae Radix Preparata）在东亚医学中传统上被用于治疗与衰老相关的肾虚引起的听力障碍。然而，它们对年龄相关性听力损失（ARHL）的作用机制尚不明确。

研究目的

本研究旨在评估菟丝子与熟地黄组合提取物（TS）对ARHL的保护作用，重点探讨其对GABA能信号传导和中枢听觉增益的影响。

材料与方法

体内实验在自然衰老的C57BL/6N小鼠中进行，体外实验使用经3-巯基丙酸（3-MPA，一种GAD抑制剂）处理的HEI-OC1听觉细胞进行验证。听觉功能通过听觉脑干反应（ABR）和晚潜伏期反应（LLR）进行评估。分子和生化分析包括听觉丘脑中的Gad1 mRNA、GAD67蛋白以及谷氨酸/GABA比率。

结果

衰老过程伴随着Gad1表达、GAD67蛋白和GABA水平的逐渐下降，同时谷氨酸/GABA比率升高，中枢听觉增益增加。TS提取物的应用恢复了GABA能标志物，稳定了神经递质平衡，并改善了ABR反应，同时降低了中枢听觉增益。在HEI-OC1细胞中，TS提取物减轻了3-MPA引起的细胞毒性，保持了Gad1/GAD67的表达；丙戊酸作为阳性对照，证实了其GABA能机制。

结论

TS提取物对ARHL具有保护作用，这与其恢复GABA能功能及调节中枢听觉增益失调有关。这些发现支持了菟丝子和熟地黄在听力障碍中的民族药理学应用，并凸显了其在年龄相关性神经退行性疾病中的治疗潜力。

引言

年龄相关性听力损失（ARHL）是老年人中最常见的慢性疾病之一，其特征是外周听觉敏感性和中枢听觉处理能力逐渐下降（Choi和Chung，2011）。耳蜗退化会导致听觉阈值升高，但最新研究表明，衰老还会削弱中枢听觉通路（包括丘脑和听觉皮层）中的抑制性神经传递（Caspary等人，2008；Harris等人，2022）。GABA能活性的降低，部分原因是谷氨酸脱羧酶1（GAD1/GAD67）表达减少，这破坏了兴奋与抑制之间的平衡（Chattopadhyaya等人，2007；Lau和Murthy，2012）。这种不平衡被认为是导致中枢听觉增益异常增强的主要原因（Duan等人，2000；Zhou和Danbolt，2014）。中枢听觉增益升高与ARHL患者的听觉时间分辨率和频谱分辨率下降、言语感知能力减弱以及听觉努力增加密切相关（Caspary等人，1995；Sheft等人，2012）。 直接针对GABA能功能障碍或中枢听觉增益的治疗方法仍然有限。具有多种药理作用的天然产物作为潜在的年龄相关性神经化学失衡调节剂受到了关注。在传统东亚医学中，年龄相关性听力下降归因于肾精不足，这与《黄帝内经》中“肾开窍于耳”的理论一致。历史上，熟地黄及其加工形式熟地黄（Rehmanniae Radix Preparata）被用于滋养肾阴并支持听觉功能。经典医书《明医别录》记载熟地黄有益于耳朵和眼睛，明代药典《本草纲目》进一步描述了熟地黄能够补充骨髓、精液和血液，同时改善听觉清晰度。菟丝子（Cuscuta chinensis Lamark的种子）同样被归类为补肾草药，在早期中国药典《神农本草经》和现代《中华人民共和国药典》中记载其可用于治疗肝肾虚引起的耳鸣等症状。在韩国传统医学中，这两种草药被组合成经典方剂双补丸（Ssangbohwan），该方剂记载于《东医宝鉴》（1613年）和《 Bangyakhappyeon》（1884年）中，用于治疗耳鸣、头晕和听力下降。这些历史资料为菟丝子和熟地黄在听力障碍中的传统应用提供了明确的民族药理学证据。 现代药理学研究初步支持了这种草药组合的传统用途。据报道，双补丸的水提取物能抑制破骨细胞分化并减少炎症模型中的骨质流失（Kim等人，2015）。含有菟丝子和熟地黄的提取物在生殖损伤模型中也表现出抗氧化、抗凋亡和组织保护作用（Han等人，2023）。此外，包括我们团队在内的多项最新研究显示，该组合在感觉神经性听力损伤模型中具有保护作用（Hong等人，2023）。每种草药都含有与衰老和听觉保护相关的生物活性成分：菟丝子富含黄酮类化合物（Donnapee等人，2014），而熟地黄含有5-羟甲基呋喃（5-HMF，一种关键加工衍生物，Chang等人，2011），可保护听觉细胞免受氧化损伤（Yu等人，2006）。然而，尽管有这些有希望的发现，目前尚不清楚该组合是否能够影响GABA能神经传递、恢复兴奋与抑制的平衡或调节中枢听觉增益——这些被认为是ARHL的重要机制。 使用3-巯基丙酸（3-MPA）抑制GABA合成的药理学方法提供了Gad1抑制及由此导致的E/I平衡变化的体外模型（Horton和Meldrum，1973；Netopilová等人，1997）。结合体内衰老模型，这种方法可以评估与ARHL相关的细胞和系统层面的机制。为了验证恢复这些GABA能缺陷的可行性，使用丙戊酸（VA）作为标准阳性对照。VA通过多种机制增强中枢GABA能神经传递，包括刺激GAD介导的GABA合成、抑制GABA降解以及通过组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制调节GABA相关基因表达（L?scher，1999；Monti，2009）。与针对单一受体或酶的制剂不同（Sigel和Steinmann，2012），VA能更全面地恢复抑制性张力，使其成为GAD缺乏和E/I失衡模型的合适对照。 本研究探讨了菟丝子与熟地黄组合提取物（TS）是否能够恢复衰老听觉系统中的抑制功能。通过测量Gad1/GAD67表达、谷氨酸和GABA水平以及中枢听觉增益的变化，评估了其效果。还分析了Slc1a2、Slc32a1和Bdnf的表达，以了解与兴奋性和抑制性调节相关的更广泛机制。在3-MPA处理的听觉细胞中进行了补充体外实验，以确定TS是否直接对抗Gad1抑制及由此导致的神经化学失衡。此外，还进行了计算机模拟启动子预测和分子对接分析，以探讨TS衍生物与GAD1/GAD67及上游转录因子之间的潜在相互作用。这些方法综合应用，以评估TS是否可作为多靶点天然干预措施，有助于稳定GABA能信号传导并减轻ARHL中的中枢听觉功能障碍。

混合比例优化

由于菟丝子和熟地黄的提取产量差异较大，原料输入比例3:1、2:1、1:1、1:2和1:3对应的最终提取比例分别约为1:2.4、1:3.5、1:7.1、1:14.3和1:21.4（重量比）。这些比例在相同条件下使用HEI-OC1听觉细胞进行了MTT存活率测定，以评估其细胞保护潜力（图S1）。基于此筛选结果，后续实验得以进行。

TS的植物化学特性

HPLC分析显示TS中含有5-羟甲基呋喃（5-HMF）和绿原酸作为标志化合物。5-HMF和绿原酸的保留时间分别为6.145分钟和14.460分钟。IVT03批次中5-HMF和绿原酸的含量分别为2.18 ± 0.15毫克/克和1.82 ± 0.011毫克/克（图1）。校准曲线方程、相关系数、检测限（LOD）、定量限（LOQ）和标志物含量详见表2。

年龄相关的中枢听觉增益变化

年龄相关的GABA能抑制和中枢听觉增益失调

年龄相关性听力损失（ARHL）表现为听觉阈值升高和噪声环境中的声音辨别能力下降（Choi和Chung，2011）。根据中枢听觉增益理论，外周输入减少会触发中枢听觉系统的代偿性放大，但年龄相关的GABA能抑制减弱可能导致这种代偿过程转变为病理性神经过度激活（Caspary等人，1995；Harris等人，2022）。

结论

本研究表明，年龄相关性听力损失伴随着丘脑中GABA能调节的逐渐紊乱，表现为Gad1表达下降、GAD67蛋白水平降低以及谷氨酸/GABA比率升高。GABA合成的药理学抑制和丙戊酸治疗进一步证实了GABA能活性受损与听觉增益控制改变之间的关联。TS提取物的应用有效恢复了GABA相关标志物。

作者贡献声明

Nevedita Murughanantham：研究工作 Do Hoon Kim：研究工作 Min Cheol Kim：研究工作 Subha Pandian：研究工作 Tong Ho Kang：监督、概念设计 Na Woo Kim：撰写——审稿与编辑、方法学、数据分析 Gyeong Jin Seo：撰写——审稿与编辑、数据分析 Kwang Won Jeong：概念设计 Youn Hee Nam：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学、数据分析 Bin Na Hong：监督、概念设计

伦理声明

所有涉及动物的实验均严格遵循NIH关于实验动物护理和使用的指南，并获得了京熙大学动物护理和使用委员会（KHUASP(SE)-15-17的批准。

利益冲突

作者Y.H.N.、N.W.K.、H.N.H.和B.N.H.受雇于Invivotec有限公司。其余作者声明本研究在没有任何可能构成利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。

数据可用性

数据包含在文章中。

利益冲突声明

作者Y.H.N.、N.W.K.、H.N.H.和B.N.H.受雇于Invivotec有限公司。其余作者声明本研究在没有任何可能构成利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。

致谢

本研究得到了韩国中小企业和创业部（MSS）资助的技术发展计划（项目编号00283092和S3312902）的支持。