《Advanced Science》：Programmable Klebsiella pneumoniae Phage Tropism Enabled by Scalable Receptor-Binding Protein Mining and Modular Assembly
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本研究针对多重耐药病原体噬菌体疗法的临床转化瓶颈——噬菌体宿主范围（host range）狭窄且难以预测，提出了一种可扩展、数据驱动的系统性解决方案。研究者以肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）为模型，从公共数据库大规模挖掘Przondovirus噬菌体的受体结合蛋白（RBP），建立了超过50个功能簇，成功将实验验证的荚膜位点（KL）靶点从14个扩展至32个。通过鉴定保守锚定基序，实现了Prz_RBP1与Prz_RBP2的“即插即用”式模块化组合，从而可编程地改造噬菌体趋向性。该框架将原始基因组多样性转化为可定制的抗菌制剂，为精准噬菌体治疗提供了通用蓝图。
可编程的肺炎克雷伯菌噬菌体趋向性：基于规模化受体结合蛋白挖掘与模块化组装实现
引言
抗菌素耐药性（AMR）已成为全球健康危机。噬菌体疗法作为一种高度特异性的替代方案，其临床应用受到大多数噬菌体宿主范围狭窄的限制。尽管公共数据库已储存数以万计的噬菌体基因组，但缺乏将这一序列空间转化为具有明确受体特异性的“设计者噬菌体”的系统性路径。本研究旨在建立一个可扩展、数据驱动的框架，将受体结合蛋白（RBP）多样性转化为用于可编程噬菌体工程的模块化工具包。
结果
2.1 Przondovirus噬菌体中的两种RBP：Prz_RBP1与Prz_RBP2
在感染肺炎克雷伯菌的噬菌体中，Przondovirus是丰度最高的属，其已实验验证的RBP可靶向14种不同的荚膜类型，显示出最广泛的宿主识别范围。比较基因组学分析显示，Przondovirus噬菌体基因组在除编码尾部纤维或尾钉蛋白（即RBPs）的区域外高度保守，而RBPs通常决定宿主特异性。通过AlphaFold3预测结构，这些RBPs可根据结构特征和功能域分为两类，分别命名为Prz_RBP1和Prz_RBP2。Prz_RBP1通常包含四个功能域：(1) 类似T7gp17的N端结构域，连接蛋白与基板；(2) 灵活的类似T4gp10的结构域，作为RBP2的锚定点；(3) 具有特征性右手平行β螺旋结构的催化结构域，作为去聚合酶识别并降解荚膜多糖（CPS）；(4) 稳定三聚体形成的C端结构域。相比之下，Prz_RBP2包含三个结构域，缺乏连接RBP与基板的保守T7gp17样N端结构域。值得注意的是，Prz_RBP2的N端锚定在Prz_RBP1的T4gp10样结构域上，从而促进其与Prz_RBP1的结构关联。
2.2 Przondovirus噬菌体中RBPs的聚类及其与荚膜类型的相关性
对280个非冗余Prz_RBP蛋白序列进行系统发育分析，结果表明Prz_RBP1和Prz_RBP2各自形成了多个不同的簇。簇内序列相似性高，而相邻簇间相似性显著降低，显示出清晰的进化边界。在Prz_RBP1中，183个RBPs被分为29个不同的系统发育簇。其中10个簇包含功能注释的RBPs，分别靶向9种不同的KL类型（KL64, KL103, KL57, KL47, KL3, KL11, KL8, KL101, KL104），另有一个簇的RBP可同时靶向KL30和KL69。这种聚类模式表明Prz_RBP1中的单个RBP簇与特定KL类型之间存在强相关性。在Prz_RBP2中，97个RBPs被分配到22个簇。有4个簇的功能注释已知，分别靶向KL21, KL47, KL56和KL5。值得注意的是，Prz_RBP1和Prz_RBP2都编码靶向KL47的RBPs，但这些RBPs显示出显著的序列分化和明显的结构差异，表明它们可能独立进化以识别结构不同的KL47荚膜多糖变体。
2.3 Przondovirus噬菌体中RBPs的功能表征
为了研究未表征RBP簇的功能，研究者从15个成员数大于等于3的未注释Prz_RBP1和Prz_RBP2簇中各选择了1-4个RBP，共27个候选蛋白。此外，还从12个成员数少于3的簇中各选择了一个RBP。加上来自已注释簇的8个RBP，总共选择了47个RBP候选，其中41个成功以可溶形式表达。研究者建立了一个包含174株临床分离株（代表88种不同荚膜类型）的测试面板。通过点斑试验系统筛选了41种可溶RBPs与代表88种KL类型的细菌菌株的相互作用。结果显示，41种可溶RBPs中，有32种在代表24种不同KL类型的菌株上产生了可检测的晕圈。这些RBPs属于21个不同的RBP簇，其中19个簇仅与单一KL类型相关，显示出识别的高度特异性。重要的是，在鉴定出的19个簇中，有14个代表新型RBP-KL类型相互作用的簇是本研究新表征的，显著扩展了功能性RBPs的已知库。基于结构特征和序列同源性，这些新型RBPs被分为RBP1家族（靶向KL107, KL110, KL111, KL169, KL20, KL25, KL43, KL71, KL62）和RBP2家族（靶向KL18, KL2, KL16, KL57, KL10）。此外，研究者还鉴定出两个含有具有多荚膜靶向能力的Prz_RBP1s的簇。例如，来自一个簇的RCIP0018_RBP1和vB_Kpn_K10PH82C1_RBP1对KL20、KL112和KL132表现出去聚合酶活性。总计，包括这些多荚膜RBPs在内，本研究表征的RBP库提供了针对额外18种KL类型的靶向能力，显著扩展了可编程噬菌体工程的组件库。通过构建五种KL类型（KL20, KL25, KL64, KL107, KL112）的CPS缺陷型突变体并进行点斑试验和体外CPS消化实验，进一步证实CPS是所测试RBPs的直接靶点。
2.4 基于RBP簇的宿主预测广泛适用于不同噬菌体
为评估聚类策略是否适用于其他属的噬菌体，研究者将分析扩展到Drulivirus RBPs。在调查的155个Drulivirus噬菌体中，大多数编码单个可归类为Dru_RBP1或Dru_RBP2的RBP。对Dru_RBP2进行系统发育分析并将功能表征的Dru_RBP映射到系统发育树上，观察到靶向不同KL类型的RBPs形成了不同的簇，这一模式与之前的研究结果一致，支持RBP簇与KL类型之间的一一对应关系。实验合成了来自五个不同簇的五个代表性RBP基因并评估其活性，点斑试验显示这些RBPs分别选择性靶向KL51、KL24、KL64、KL39和KL62。这些发现进一步证明，RBP挖掘和聚类策略可广泛应用于不同的噬菌体属。
2.5 利用RBP模块对底盘噬菌体RCIP0109进行宿主范围重编程
鉴定出的RBP模块为噬菌体工程提供了一个全面的工具包，便于在统一的底盘噬菌体框架内精确调节宿主范围。选择Przondovirus属的代表性成员RCIP0109作为底盘噬菌体。为重新编程宿主特异性，研究者利用同源重组将噬菌体RCIP0109的两个天然RBP替换为靶向KL20和KL112的噬菌体RCIP0018的RBP1。得到的工程化噬菌体RCIP0109R1失去了感染KL2和KL111宿主的能力，但获得了针对KL20和KL112菌株的裂解活性，证明了宿主特异性的成功重编程。接下来，通过用噬菌体RCIP0069的相应RBP（分别靶向未知KL类型和KL57）替换RCIP0109的两个天然RBP，构建了重组噬菌体RCIP0109R2。该工程化噬菌体失去了对KL2和KL111的活性，但获得了裂解KL57的能力。基于此策略，进一步构建了靶向两种临床流行肺炎克雷伯菌荚膜类型KL64（RCIP0028_RBP1）和KL25（BUCT-3589_RBP1）的工程化噬菌体，分别命名为RCIP0109R3和RCIP0109R4。替换RBP模块后，这些工程化噬菌体失去了感染其原始宿主（KL2和KL111）的能力，同时获得了分别针对KL64和KL25的裂解活性。这些结果表明，RBP模块可以有选择地组装到底盘噬菌体上，以实现模块化和可预测的宿主特异性重编程。
2.6 Prz_RBP1和Prz_RBP2模块的组合配对实现可编程噬菌体趋向性
Prz_RBP1包含一个T4gp10样结构域，被提议作为Prz_RBP2的锚定平台。此外，Prz_RBP2的N端含有一个短的保守氨基酸基序，被认为介导其与Prz_RBP1的相互作用。基于此结构，研究者假设T4gp10样结构域和Prz_RBP2中的N端基序共同形成了一个模块化界面，使得来自不同噬菌体来源的RBPs能够组合组装。对183个Prz_RBP1序列中T4gp10样结构域的分布分析发现，其中84个含有该结构域，覆盖了19种Prz_RBP1s靶向的KL类型中的22种，表明T4gp10样结构域是广泛保守的。对97个Prz_RBP2蛋白的N端区域分析，在所有序列中都发现了一个约30个氨基酸的保守基序。这些发现支持这两种互补结构元件在Przondovirus RBP库中普遍存在。
为功能验证这种模块化相互作用，首先用靶向KL20/KL112的RCIP0018_RBP1替换了天然的RCIP0109_RBP1，同时保留天然RBP2。所得重组噬菌体RCIP0109R5失去了感染KL111的能力，但获得了针对KL20/KL112的裂解活性，同时保留了对KL2的活性。接下来，用靶向KL47的P560_RBP2替换了天然的RCIP0109_RBP2，同时保留天然RBP1。工程化噬菌体RCIP0109R6失去了对KL2的活性，但获得了针对KL47的裂解活性，同时保留了对KL111的感染性。最后，为了测试来自不同噬菌体的RBPs之间的模块化兼容性，将来自噬菌体BUCT-3589的靶向KL25的BUCT-3589_RBP1与来自噬菌体P560的靶向KL47的P560_RBP2共组装。所得噬菌体RCIP0109R7失去了其天然宿主范围（KL2和KL111），但同时获得了针对KL25和KL47的裂解活性。这些数据表明，含有T4gp10样结构域的Prz_RBP1s和含有保守N端基序的Prz_RBP2s作为可组合的模块发挥作用，通过它们的自由配对，能够实现噬菌体趋向性的可预测且非冗余的定制。
作为应用级验证，研究者基于工程化噬菌体配制了噬菌体鸡尾酒，以展示其对流行CRKP谱系的精确荚膜类型靶向和广泛覆盖。结果表明，RCIP0109R7能有效清除KL47–KL25混合培养物，RCIP0109R5能有效消除KL2、KL20和KL112混合培养物。当所有五种KL类型菌株混合时，RCIP0109R7或RCIP0109R5单独使用清除效果有限，而双噬菌体鸡尾酒则能有效根除混合细菌群落。这些结果表明，基于模块化RBP工程的合理噬菌体鸡尾酒设计可以为临床多样化的CRKP种群提供可预测且全面的覆盖。
2.7 异源RBP2在噬菌体RBP1上的组装产生多价噬菌体种群
考虑到Prz_RBP1和Prz_RBP2模块的组合配对能够实现可编程的噬菌体趋向性，研究者假设在细菌体内提供多种Prz_RBP2变体将允许它们与Prz_RBP1共组装，从而产生具有不同Prz_RBP1-RBP2组合的噬菌体种群。为验证这一假设，设计了一个实验，其中外源Prz_RBP2在宿主细胞内由质粒表达，使噬菌体在感染和组装过程中能够同时整合天然和外源RBP2。该方法有望产生具有扩展宿主范围的子代噬菌体。研究者构建了一个阿拉伯糖诱导型质粒pColad-donor1，携带靶向KL2的RCIP0109_RBP2模块，并将其转化到菌株161（KL20）中。当噬菌体RCIP0109R1感染携带该质粒的菌株161时，产生的子代噬菌体表现出扩展的宿主范围。子代噬菌体在KL20菌株上形成噬菌斑，表明RCIP0109R1正常感染。在KL2宿主上，高密度点斑试验显示出特征性的“自外裂解”表型。这些结果表明，子代种群包含亲本RCIP0109R1和一个被指定为伪RCIP0109R1的工程化变体，后者同时组装了RBP1和外源RBP2，同时保留了RCIP0109R1基因组。此外，在携带质粒的菌株8-41中传代这些子代噬菌体后，发现工程化变体伪RCIP0109R1可以在此宿主背景中稳定繁殖。
然后，用天然携带Prz_RBP1和Prz_RBP2的噬菌体RCIP0109感染携带编码P560_RBP2（靶向KL47）的质粒pColad-donor2的17u111菌株。所得子代噬菌体在KL111和KL2菌株上均形成噬菌斑。值得注意的是，在KL47平板上进行的高密度点斑试验显示出LO表型。这些子代噬菌体可以在携带质粒的菌株334847中稳定繁殖，其滴度与特异性靶向KL47的合成噬菌体RCIP0109R7相当。
总之，这些结果证实，即使在天然RBP2存在的情况下，外源提供的RBP2变体也可以通过与宿主噬菌体固有的Prz_RBP1配对，有效地整合到组装的噬菌体颗粒中。这种组装策略可以产生具有显著扩展宿主范围的混合噬菌体种群，直接验证了所提出的RBPs模块化随机组装的假说。
讨论
本研究展示了一个完整的工作流程，弥合了大规模噬菌体基因组资源与经过功能验证、可定制的针对多重耐药病原体的噬菌体治疗剂之间的差距。选择肺炎克雷伯菌作为临床相关模型，是因为其荚膜多样性广泛，且被世卫组织列为重点病原体。肺炎克雷伯菌的荚膜虽然是噬菌体识别的关键，但高度多样化，因此对有效的噬菌体治疗构成重大障碍，因为大多数噬菌体只识别一种荚膜类型。这种高抗原多样性需要相应多样化的RBP库，而RBP是宿主识别和荚膜降解的核心。然而，尽管公共数据库中RBP序列迅速积累，但只有一小部分被功能注释，且控制其宿主特异性的模块化原理仍然定义不清。
为此，研究者专注于Przondovirus属，其噬菌体在感染肺炎克雷伯菌的噬菌体中拥有最大的已知基因组代表性，并共同靶向最广泛的KL谱。对280个Przondovirus RBPs的比较分析揭示了多个定义明确的序列簇：每个簇内氨基酸同一性高，但相邻簇间急剧下降。十四个簇已包含生化验证的靶向不同K抗原（荚膜）类型的RBPs，强调了RBP序列与受体趋向性之间的紧密联系。因此，许多尚未注释的簇构成了一个丰富的假定RBP库，其特异性仍然未知，并作为本研究的起点。
基于这一观察，研究者设计了一个自下而上的工作流程，将计算机聚类与实验筛选相结合，系统地为Przondovirus RBPs分配功能。对41个先前未表征的RBPs进行功能验证，将已知的靶向谱扩展到32种荚膜（KL）类型，其中几种在当今的多重耐药肺炎克雷伯菌谱系中占主导地位。对金黄色葡萄球菌噬菌体的并行调查证明了该方法的普遍性：那里不同的RBP簇对特定的壁磷壁酸骨架或糖基化变体表现出特异性偏好，证实基于簇的分类在不同细菌物种中捕获了具有生物学意义的受体特异性。有趣的是，靶向KL57的RBPs在Prz_RBP1和Prz_RBP2分支中都有发现，在保守的催化结构域中共享高达90%的同一性，表明RBP模块化可能促进噬菌体之间的水平基因转移。此外，研究者观察到一些RBPs可以靶向多种KL类型。例如，在KL111簇的三个RBP成员中，尽管它们的氨基酸序列共享超过90%的同一性且结构几乎相同，但NC_047968_RBP1和RCIP0109_RBP1仍可分别额外识别KL22和KL13。这可能是由于RBPs荚膜结合位点的细微变化增加了它们的耐受性，从而能够识别其他KL类型。这种跨KL识别在先前的研究中也有报道。总体而言，这些观察表明，RBP内的微小序列变异可以赋予额外的KL特异性识别。
研究者系统分析了来自280个Przondovirus噬菌体的RBPs，发现基于结构域架构，它们可以分为两个不同的类别，分别命名为Prz_RBP1和Prz_RBP2。84个Prz_RBP1蛋白含有一个T4gp10样分支结构域，而每个Prz_RBP2都包含一个约30个氨基酸的保守肽段，起到类似的锚定功能。在先前的研究中，结构和生化证据表明，T4gp10样结构域和这些保守肽段可能以分支构型组装两个或更多尾钉。因为这些支架在整个Przondovirus属中普遍存在，它们可能为靶向多种荚膜类型的工程化噬菌体的模块化构建提供了一个现成的遗传工具包。研究者证明，含有T4gp10样结构域的Prz_RBP1和含有保守N端基序的Prz_RBP2作为模块化和可组合的单元发挥作用。用来自不同噬菌体的多种Prz_RBP1和Prz_RBP2蛋白组装的重组噬菌体表现出宿主范围的可预测转变，与交换的RBPs的特异性相对应。通过利用Prz_RBP1和Prz_RBP2自由配对的能力，研究者开发了一种策略，能够构建一个能够靶向多种荚膜类型的噬菌体种群。研究者外源提供Prz_RBP2基因，使其能够无缝整合到组装的病毒颗粒中。这种模块化兼容性有效地规避了基因组包装限制，并消除了复杂遗传重建的需要，从而能够以最低的工程成本产生具有扩展宿主范围的子代噬菌体。
总之，本研究提出了一种可扩展的系统级策略，将可用的噬菌体基因组数据转化为功能性的模块化部件库。这使得能够构建具有定制宿主特异性的可编程噬菌体，克服了当前噬菌体治疗的局限性，并为建立在合成生物学基础上的精准抗菌剂奠定了基础。
