《Advanced Science》：Bacterial Outer Membrane Vesicles in Potentiating Cancer Vaccines: Progress and Prospects
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这篇综述系统探讨了利用细菌外膜囊泡（OMV）作为多功能平台来增强肿瘤疫苗疗效的最新进展。文章详细阐述了OMVs的生物学特性、增强免疫应答的多种机制（如激活先天免疫、诱导适应性免疫应答和重塑肿瘤微环境），并全面总结了基因工程、表面展示、核酸与药物装载以及原位疫苗策略等多种工程化方法。最后，文章展望了结合人工智能、肿瘤微环境分析和新生抗原发现等技术，推动下一代个性化OMV免疫疗法的发展前景。
细菌外膜囊泡（OMVs）是革兰氏阴性菌在正常生长或应激条件下释放的纳米级膜囊泡，因其天然的免疫调节特性和卓越的工程灵活性，已成为增强肿瘤疫苗效力的多功能平台。本文深入探讨了OMVs的生物学特性、增强肿瘤疫苗效果的机制及其多样化的工程策略。
2 与肿瘤疫苗相关的OMVs生物学特性
OMVs由细菌外膜和胞周质向外出芽形成，呈不对称双层结构，富含脂多糖（LPS）、脂寡糖（LOS）、脂蛋白、外膜蛋白（如OmpA, PorB）、肽聚糖片段、细菌核酸和糖基化抗原等免疫活性成分，这些成分统称为病原相关分子模式（PAMPs）。这些PAMPs可被宿主免疫细胞上的模式识别受体（PRR）识别，如Toll样受体（TLR）和NOD样受体（NLR），从而启动强烈的先天免疫激活。例如，LPS主要通过TLR4介导的信号通路激活NF-κB和MAPK通路，促进促炎细胞因子的释放和树突状细胞（DC）的成熟。
OMVs的这些免疫活性物质能促进DC成熟，增强抗原摄取、加工和交叉呈递，有效连接先天免疫和适应性免疫。它们还能调节巨噬细胞功能，通过增强吞噬作用和促进其向促炎的M1表型极化，减少肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制信号，并增强细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的浸润。通过理性的工程策略，例如对脂质A生物合成途径进行遗传改造，可以在保持TLR4激动活性的同时显著降低内毒素活性，从而在安全性和免疫激活之间取得平衡。
3 OMV增强肿瘤疫苗效果的机制见解
OMVs通过多层次的机制增强肿瘤疫苗的效果。首先，它们能有效激活先天免疫和诱导训练免疫。OMVs表面富集的PAMPs被宿主PRRs识别，触发下游炎症信号通路并募集各种免疫细胞类型，包括中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。例如，OMVs刺激血管内皮细胞通过TLR4–NF-κB信号轴快速分泌趋化因子如IL-8和CXCL1，驱动中性粒细胞在炎症早期有效募集。被激活的中性粒细胞会释放TNF-α和IL-1β并形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs），从而放大局部炎症并增加抗原可及性。
更重要的是，OMVs可在单核-巨噬细胞谱系中建立长期的训练免疫。PAMPs激活骨髓单核祖细胞中的NLRP3–Caspase-1–IL-1β炎症小体通路，并刺激mTOR–HIF-1α代谢轴，导致IL-1β释放和代谢重编程。这些代谢信号诱导稳定的表观遗传重塑，其特征是组蛋白标记如H3K4me3的富集，从而重塑造血祖细胞的转录景观，产生促炎的训练单核细胞。这些细胞在分化后呈现M1样表型，持续分泌IL-1β、TNF-α、IL-6以及CXCL9/10，从而强化DC成熟、抗原呈递和T细胞激活。
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其次，OMVs作为纳米级囊泡，具有淋巴引流的内在优势，能有效进入次级淋巴器官并被DCs捕获，从而促进抗原呈递和适应性免疫应答的建立。成熟的DCs一方面通过MHC-II分子将抗原呈递给CD4+T辅助细胞，增强Th1/Th2免疫应答；另一方面，它们通过将外源抗原装载到MHC-I分子上介导交叉呈递，从而激活CTL并诱导强大的细胞毒效应。这一机制打破了“外源抗原仅依赖MHC-II通路”的传统局限，被认为是OMVs增强肿瘤疫苗效力的关键过程。
第三，OMVs能够重塑肿瘤微环境（TME）并诱导免疫原性细胞死亡（ICD）。OMVs可以通过调节肿瘤浸润免疫细胞的表型和信号网络来逆转TME中的免疫抑制条件。例如，它们可以促进肿瘤相关巨噬细胞（TAM）从免疫抑制性M2表型向促炎性M1表型极化。工程化的OMVs还可诱导PD-L1的溶酶体依赖性降解，有效克服免疫检查点抵抗。此外，OMVs可以激活caspase-11–gasdermin D通路以触发细胞焦亡，并释放钙网蛋白（CRT）、ATP和高迁移率族蛋白1（HMGB1）等损伤相关分子模式（DAMPs），从而促进DC成熟和CD8+T细胞浸润。将OMVs与外部物理化学刺激相结合进一步扩展了其免疫调节范围。例如，Hf-多酚修饰的OMVs引入了高Z元素铪以增强放疗下的局部能量沉积，并催化H2O2分解以缓解肿瘤缺氧，从而显著放大放疗诱导的ICD信号。
4 OMV基肿瘤疫苗的工程策略
为了克服当前肿瘤疫苗免疫原性不足、抗原呈递效率低、TME高度免疫抑制以及难以建立持久抗肿瘤免疫记忆等挑战，研究者们发展了一系列系统的OMV工程策略。
4.1 亲本菌株的基因工程
遗传减毒和蛋白质组最小化成为关键突破。删除msbB基因可降低脂质A的酰化水平，从而将内毒素活性降低约80%，同时仍能保持TLR4信号传导和细胞因子分泌。同时，系统性去除约60种非必需外膜蛋白可获得均一性更好、产量更高的OMV。这种“蛋白质组降维”方法不仅减少了免疫学噪音，还增强了免疫应答的稳定性和可预测性。此外，删除nlpI基因可显著增强OMV的生物合成，从而开发出装载透明质酸酶的高产囊泡菌株，该系统有助于降解肿瘤细胞外基质中的透明质酸（HA），从而改善治疗剂在瘤内的分布。
4.2 表面展示技术
表面展示技术使OMVs从“天然免疫刺激实体”转变为“可编程疫苗平台”。早期研究使用ClyA、FhuD2和Trx等外膜蛋白作为锚定组件，在OMV表面可靠展示肿瘤抗原。基于SpyTag/SpyCatcher共价偶联系统的“即插即显”平台不仅显著增强了CD8+T细胞活化和交叉呈递，还赋予了OMVs“即插即用”的模块化能力。随后的SNAP-OMV平台无需基因重建即可实现抗原快速替换。OMVax系统则可调节表面电荷，从而精确控制抗原吸附能力和释放动力学。
这些技术进展使得OMV从基础的抗原载体转变为具有靶向导航和持久免疫激活能力的智能疫苗单元。例如，αDEC205受体介导的DC靶向策略支持直接的抗原摄取并提高了交叉呈递效率。通过SpyCatcher/SpyTag系统将抗原（OVA）和免疫检查点抗体（αPD-L1）共价连接到同一个OMV表面，确保了抗原呈递和免疫阻断在空间上的协同。
4.3 核酸装载策略
OMVs可作为核酸载体，封装DNA或mRNA以实现体内抗原表达和持续呈递。例如，LOMV@PD-1系统递送编码PD-1的质粒DNA，使肿瘤细胞内源性产生PD-1，实现对PD-L1的自阻断作用。利用RNA结合蛋白L7Ae和溶酶体逃逸蛋白LLO开发的mRNA表面展示系统，能使mRNA在DCs内高效翻译并诱导交叉呈递。囊泡性口炎病毒糖蛋白（VSVG）修饰的OMVs利用酸敏感膜融合机制将siPD-L1直接递送到肿瘤细胞的细胞质中，从而实现高效的PD-L1基因沉默。
4.4 用于免疫调节的药物装载策略
为了进一步提升基于OMV的肿瘤疫苗的免疫治疗潜力，功能化的OMVs被设计为不仅递送治疗分子，还调节抗原释放、提高免疫激活阈值、增强信号通路并支持记忆形成。装载锰（Mn）的OMVs在酸性或低氧条件下释放Mn2+，触发线粒体或胞质DNA泄漏，激活cGAS–STING通路。金属-酚醛OMVs通过单宁酸和铪离子之间的配位构建，能有效缓解肿瘤缺氧。将OMVs与溶瘤病毒、自噬通路或PANoptosis信号相结合，可以触发广泛的抗原释放和免疫增强。例如，OMVs@P2O-Ads与腺病毒疗法相结合可增强自噬和交叉呈递。将CpG（一种TLR9激动剂）与OMVs结合的CpG@MSN-PEG/PEI@OMVs平台实现了双通路免疫协同。
4.5 原位疫苗策略
原位疫苗策略旨在通过诱导ICD和释放肿瘤相关抗原及DAMPs，将肿瘤本身转化为“疫苗工厂”。光热疗法（PTT）-OMV系统在近红外照射下触发ICD，促进CRT暴露和HMGB1释放。光动力疗法（PDT）-OMV系统依赖光敏剂介导的ROS产生和ATP分泌来改善交叉呈递。金属催化OMV平台或焦亡诱导OMV平台可以增加DAMP表达。通过添加马来酰亚胺官能团，OMVs可以在肿瘤部位共价捕获抗原，显著延长抗原滞留并增强呈递效率。
4.6 提高OMVs产量和一致性的策略
实现高产量和批次间一致性对于OMVs的临床转化至关重要。削弱外膜与肽聚糖层之间的机械连接是控制囊泡释放效率的关键因素。删除lpp、ompA、nlpI以及tolA/tolR/pal等基因可显著增加囊泡形成。破坏外膜脂质不对称性也能显著促进OMV释放。此外，优化培养条件和工艺参数是提高OMV产量的重要途径。氧气水平和铁可用性调节氧化平衡，适度的超氧或铁剥夺会触发应激反应从而增强OMV释放。抗生素诱导的应激通过膜破坏、SOS激活和细胞壁合成抑制促进囊泡分泌。使用功能性抑制剂对肽聚糖重塑进行化学调节，可在多个菌株中实现可逆的OMV产量控制，产量提高高达60倍，且无需基因改造。生物反应器为基础的连续培养进一步提高了OMV产量和批次一致性。
OMV生产的质量控制评估通常依赖于物理化学、安全性和成分参数的综合评估。标准的物理化学表征包括囊泡尺寸分布、形态和均一性。脂多糖含量和内毒素活性仍是关键的安全参数。此外，外膜蛋白质组指纹图谱对OMV身份验证和一致性评估具有重要价值。标准化框架建议将定量蛋白质组谱与物理化学参数相结合，以提高批次可追溯性和免疫学可预测性。
展望
结合人工智能、肿瘤微环境分析和新生抗原预测等先进技术，有望推动基于OMV的下一代个性化、智能化精准疗法的发展。尽管在安全性、标准化生产和临床转化方面仍面临挑战，但OMVs作为一个高度可工程化的多功能平台，展现出克服当前肿瘤疫苗研发主要障碍的巨大潜力，为未来癌症免疫治疗开辟了新的道路。
