《Advanced Science》：Redox-Responsive Polymeric Nanocapsules for Enhanced Tumor-Targeted Delivery of Antimicrobial Peptides
编辑推荐：
本工作报道了一种模块化的氧化还原响应型聚合物纳米胶囊平台，显著提升了抗菌肽（AMPs）的肿瘤靶向递送能力。以蜂毒肽（MEL）为模型，该纳米胶囊（nMEL）在生理条件下稳定惰性（溶血<5%），在肿瘤微环境（TME）中则通过谷胱甘肽（GSH）触发壳层裂解释放活性肽。体内实验显示，nMEL的肿瘤蓄积量比游离MEL高约4倍，并抑制皮下肿瘤生长约80%。整合苯硼酸（PBA）配体后，nMEL-PBA可主动靶向高唾液酸化肿瘤细胞，在肺转移模型中实现4.5倍的肺部富集，并将中位生存期延长至43天。
引言：抗菌肽的机遇与挑战
癌症是全球主要死亡原因之一，传统疗法常受复发、转移和耐药性限制。抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）作为一类新兴的抗癌剂，因其独特的作用机制而备受关注。这些短的两亲性多肽（<100个氨基酸）能优先结合带负电荷的肿瘤细胞膜，破坏脂质排列，诱导快速的裂解性死亡。此外，AMPs还能调节抗肿瘤免疫和抑制血管生成。然而，其临床转化受到蛋白水解不稳定性、溶血、全身毒性和不利的药代动力学等限制。
为克服这些障碍，目前主要有两种互补策略：合理的肽工程设计和先进的纳米递送系统。纳米载体，如树枝状大分子、脂质体、聚合物纳米颗粒等，可以增强循环、肿瘤选择性和刺激响应性释放（例如，肿瘤中的氧化还原触发活化）。然而，这些系统仍面临体内稳定性有限、过早泄漏、载药量低和合成复杂等挑战。
研究概述：模块化纳米胶囊平台的构建
本研究旨在报道一种模块化的氧化还原响应型聚合物纳米胶囊平台，以实现AMPs的系统性递送并增强其肿瘤靶向活化。研究选择蜂毒肽（Melittin, MEL）作为严格模型，它是一种具有强大抗肿瘤活性但溶血性和全身毒性很高的26残基阳离子肽。
合成与表征
通过原位聚合合成了具有二硫键交联壳层的纳米胶囊（nMEL），并系统表征了其尺寸、电荷和蛋白质构象。透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）证实其为均匀的球形颗粒，平均流体动力学直径约为14 nm，zeta电位约为-3 mV。相比之下，天然MEL呈高阳离子性（约+28 mV），表面电荷向负值的显著转变证实了成功封装。阴离子单体2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸（2-Acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid, AMPS）的引入赋予了壳层净负电荷，促进了聚合过程中与阳离子MEL的静电络合，从而支持了高封装效率。圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）进一步验证了二级结构的保留，在208 nm和222 nm处的α-螺旋特征峰与游离MEL匹配，表明封装过程保持了肽的完整性。
氧化还原响应性释放
对于治疗作用，MEL必须在肿瘤内释放。研究人员使用透析试验探究了其氧化还原响应性。在磷酸盐缓冲盐水（Phosphate-Buffered Saline, PBS）中，nMEL高度稳定，7天内累积释放量小于4%，反映了完整的交联壳层抑制了过早泄漏。为了更好地反映肿瘤细胞外氧化还原条件，他们使用了20 μM的谷胱甘肽（Glutathione, GSH），该浓度处于报道的微摩尔级细胞外范围（约2–20 μM）内。在这些模拟肿瘤的还原条件下（20 μM GSH），nMEL表现出持续释放（约20% / 7天），这与壳层中二硫键交联剂N,N-双（丙烯酰氧基）胱胺（N,N-bis(acryloyloxy)cystamine, BAC）的裂解一致，并且即使在有限的释放分数下也能检测到MEL生物活性的重新激活。
这些数据确立了该设计的一个核心功能二分法：在生理条件下具有胶体稳定性和货物封存能力，同时在还原环境中具有氧化还原触发的开封能力。AMPS单体介导的负表面电荷有助于封装和循环相容性，而二硫键交联则为按需释放提供了可控的闸门，共同实现了最小的脱靶泄漏和在肿瘤相关环境中的活化。
细胞毒性及其作用机制
MEL通过静电结合带负电荷的肿瘤细胞膜，插入其疏水结构域，采用α-螺旋构象，随后聚集形成膜孔，导致细胞裂解和死亡。在本设计中，nMEL必须首先被细胞外（肿瘤微环境水平）的GSH激活以释放MEL；释放的MEL然后吸附到肿瘤细胞膜上，破坏膜完整性，并可进入细胞质诱导细胞死亡。为了评估nMEL是否以氧化还原依赖的方式保留这种活性，研究人员首先在成熟的4T1小鼠乳腺肿瘤细胞系中检测了其细胞毒性。nMEL用GSH预处理12小时以模拟其在还原性肿瘤微环境下的行为，记为nMEL+GSH。游离MEL表现出强烈的细胞毒性，IC50为0.83 μg mL?1。nMEL+GSH相对于惰性的nMEL（IC50= 8.05 μg mL?1）显示出恢复的细胞毒性，这与GSH预处理后（12小时，根据释放曲线约3%）生物活性MEL的持续释放一致。活/死染色证实了这些发现，显示MEL和nMEL+GSH组存在广泛的细胞死亡，而nMEL组诱导的毒性最小。
为了探究潜在机制，研究人员使用异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate, FITC）标记的MEL进行了共聚焦成像。与4T1细胞孵育0.5小时后，MEL和nMEL+GSH都定位于细胞膜，表明了初始的吸附和成孔过程。相比之下，未经处理的nMEL未显示可检测的膜结合，证实了MEL没有释放。为了进一步评估长期相互作用，将Cy5.5标记的MEL和nMEL与4T1细胞孵育4小时。肌动蛋白细胞骨架的鬼笔环肽染色显示，在肌动蛋白丝存在的情况下，MEL和nMEL+GSH（红色）有明显的细胞质内化，突出了渐进的膜破坏和细胞内递送。相比之下，PBS和nMEL组显示MEL渗透可忽略不计。
这些数据表明，nMEL在生理条件下功能惰性，但在还原环境下激活以释放MEL，后者保留了其固有的膜破坏作用模式。因此，氧化还原触发的释放能够实现选择性的肿瘤细胞杀伤，同时在缺乏还原触发的情况下最大限度地减少脱靶细胞毒性。
体内生物分布与生物安全性
为了评估体内行为和机制，将Cy5.5标记的MEL和nMEL给予携带4T1皮下肿瘤的小鼠。全身荧光成像显示，nMEL在肿瘤部位持续积累长达48小时，而游离MEL在8小时内从肿瘤部位迅速清除。48小时后的离体成像证实了两组主要在肝脏/肾脏分布；值得注意的是，nMEL的肿瘤积累量比游离MEL高约4倍。血液荧光定量进一步显示nMEL循环时间延长，在48小时仍可检测到，而游离MEL在24小时后变得无法检测。
肿瘤富集的增强归因于：1）延长的系统停留时间——约14 nm的流体动力学尺寸限制了快速的肾脏过滤，温和的负表面电位（约-3 mV）减弱了调理作用和网状内皮系统（Reticuloendothelial System, RES）清除；2）二硫键交联壳层赋予的胶体稳定性，抑制了肽的过早泄漏，使更多完整的载体到达肿瘤；3）增强的渗透和滞留（Enhanced Permeability and Retention, EPR）效应，有利于长循环纳米载体在渗漏的肿瘤血管内沉积。残留的肝脏摄取与预期的单核吞噬细胞系统识别一致。重要的是，还原性肿瘤环境会裂解二硫键以释放MEL，这调和了循环中低的脱靶毒性与强大的瘤内活性。
鉴于MEL的非特异性膜裂解作用模式，首先通过将MEL或nMEL的梯度浓度与稀释的全血在37°C孵育1小时来评估溶血。nMEL引起可忽略的红细胞损伤（在80 μg mL?1时溶血<5%），与游离MEL诱导的浓度依赖性溶血形成鲜明对比。这种减弱与交联壳层内MEL的电荷屏蔽和空间限制一致，这限制了生理条件下的肽-膜相互作用。
对于全身安全性，在静脉给药14天后收集主要器官和血液。组织病理学（苏木精-伊红染色，Hematoxylin and Eosin, H&E）结合半定量损伤评分显示，MEL处理的小鼠存在器官特异性毒性：肺部显示肺泡间隔增宽、间质性炎症浸润和局灶性塌陷；肝脏显示门管区异常，伴有点状坏死和轻度肝细胞水肿；肾脏表现出肾小球耗竭、萎缩和皮质-髓质分界模糊。相比之下，nMEL处理的小鼠未显示异常的组织结构，与PBS对照组无法区分，全血细胞计数和肝/肾功能指数保持在正常范围内。
封装使MEL在循环中功能惰性，减少了溶血和脱靶暴露，而在肿瘤中的氧化还原触发释放则原位恢复了肽的活性。因此，nMEL将全身安全性与瘤内效力解耦，减轻了溶血性和器官毒性，同时保留了局部疗效，从而为体内抗肿瘤治疗提供了优异的生物相容性和转化前景。
在4T1皮下模型中的抗肿瘤疗效
将荷瘤BALB/c小鼠随机分为三组：PBS、游离MEL或nMEL。在第1、3、5、7天进行静脉给药（MEL当量2.5 mg kg?1），同时每两天监测体重和肿瘤体积。PBS对照组表现出快速的肿瘤进展，到第14天达到约1000 mm3。游离MEL实现了中等抑制（约600 mm3），而nMEL产生了显著的肿瘤控制，终末体积约为200 mm3（约PBS的20%）。切除的肿瘤质量和大体图像与这些发现一致，证实了nMEL优异的生长抑制。所有组别均保持体重稳定，表明没有急性全身毒性。组织病理学分析显示，PBS处理的小鼠肿瘤结构保存完好，游离MEL处理后出现局灶性坏死，而nMEL给药后出现广泛坏死。与这些结果一致，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL）检测显示MEL组细胞凋亡有限，而nMEL处理的肿瘤显示出广泛的凋亡信号。
nMEL的显著疗效归因于其延长的循环时间和增强的瘤内积累，随后是氧化还原触发的二硫键裂解，在靶点释放生物活性MEL。这种机制有效地将全身安全性与靶向效力分离：MEL在循环期间保持封存和惰性，从而最大限度地减少脱靶毒性，但在还原性肿瘤微环境中恢复其膜裂解活性。恢复的活性导致了明显的坏死、凋亡和肿瘤体积减小。总之，这些结果突显了聚合物纳米胶囊平台解决了AMP转化的关键障碍，包括循环不稳定性、溶血和非特异性毒性，并确立了一种在肿瘤学中利用膜活性肽的可行策略。
主动靶向型nMEL-PBA的设计与表征
在前面的章节中，氧化还原响应的nMEL减轻了游离MEL的副作用，并通过被动靶向增强了肿瘤积累。然而，MEL的非特异性膜裂解需要主动的肿瘤识别来提高细胞选择性。在此背景下，一种广泛采用的策略是用配体修饰纳米载体，这些配体能与肿瘤相关受体结合，从而加强细胞表面结合并促进受体介导的摄取。基于这些原则，研究人员选择唾液酸（Sialic Acids, SA）作为肿瘤相关靶点，它是覆盖在脊椎动物细胞表面糖蛋白和糖脂上的九碳酸性单糖。肿瘤经常表现出高唾液酸化，这与恶性进展和不良预后相关。苯硼酸与SA上的顺式二醇形成可逆的共价复合物，为配体导向的靶向提供了化学手柄。因此，研究人员将3-丙烯酰氨基苯硼酸（3-Acrylamidophenylboronic acid, PBA）引入nMEL壳层，生成nMEL-PBA，旨在增强肿瘤细胞结合，同时保留氧化还原触发的释放。
PBA采用相同的原位程序进行共聚。与nMEL相比，nMEL-PBA显示出稍大的流体动力学直径（约34 nm）和更负的zeta电位（-8.9 mV），这归因于PBA的引入。这些物理化学变化，连同未改变的胶体单分散性，支持了配体在纳米胶囊表面的成功呈现。4T1细胞系据报道与转移性较低的相关细胞系相比表现出上调的唾液酸途径活性，这与细胞表面唾液酸化能力增强一致。研究人员进一步在抑制内吞的条件下（4°C）使用FITC标记的制剂进行了竞争性细胞表面结合实验，以验证特定的PBA-SA识别可以增强nMEL-PBA的肿瘤积累。nMEL-PBA与nMEL相比，产生了显著的FITC荧光右移和显著更高的平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity, MFI），表明更强的表面结合。重要的是，用过量的游离PBA或游离唾液酸进行竞争性阻断，显著降低了nMEL-PBA的结合。
在4T1肺转移模型中的主动肿瘤靶向
通过尾静脉注射荧光素酶转染的4T1细胞（4T1-Luc）建立了4T1肺转移模型。生物发光在3-5天内证实了肺部定植。然后给小鼠静脉注射Cy5.5标记的nMEL或nMEL-PBA，并在3天后分析器官。离体成像显示肺部有强烈的荧光素酶信号，nMEL-PBA的Cy5.5信号共定位明显高于nMEL；定量分析显示nMEL-PBA的肺部积累比nMEL高约4.5倍。在使用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）表达的4T1细胞（4T1-GFP）的平行队列中，小鼠用Cy5.5标记的载体给药，并在注射后3天进行肺部切片。共聚焦显微镜显示，与nMEL相比，nMEL-PBA（红色）与GFP阳性肿瘤灶（绿色）有更大的共定位，表明在转移病灶内细胞结合得到改善。
nMEL-PBA增强的肺肿瘤定位与高唾液酸化肿瘤细胞表面的PBA-SA络合作用一致，这增强了超出EPR介导沉积的粘附和保留。这种可逆的共价相互作用在弱酸性肿瘤微环境中更有利，并补充了MEL的二硫键介导的氧化还原释放，从而将主动识别与按需肽活化结合起来。总之，这些结果表明，PBA功能化将nMEL从被动靶向升级为主动靶向，提高了向转移性肺肿瘤的递送，同时保持了平台的氧化还原触发机制。
nMEL-PBA对肺转移的抗肿瘤效果
本研究的目的是确定主动唾液酸靶向的nMEL-PBA是否能比nMEL的被动靶向更能提高生存率并抑制肺转移负荷。为此，通过静脉注射1 × 105个细胞到BALB/c小鼠体内建立了原位4T1-Luc肺转移模型。将小鼠随机分为PBS、nMEL或nMEL-PBA组。在第1、5、10、15天进行静脉治疗（2.5 mg MEL当量 kg?1）。每组6只小鼠进行生存随访，5只用于在实验中期量化转移结节。
从第12天开始的生物发光成像显示，到第20天，PBS处理的小鼠出现广泛的肺转移，而nMEL和nMEL-PBA组仅观察到微弱的信号。到第40天，所有PBS小鼠均已死亡，两只nMEL小鼠存活，五只nMEL-PBA小鼠仍然存活。到第50天，nMEL-PBA组的两只小鼠仍然存活。统计分析显示，PBS组的平均生存时间为29.00 ± 2.02天，nMEL组为38.83 ± 3.15天，nMEL-PBA组为43.50 ± 2.73天。中位生存时间分别为30天、39天和43天。寿命延长率计算为nMEL组30%，nMEL-PBA组43.3%。这些数据表明，两种制剂都显著延长了生存期，其中nMEL-PBA带来的益处最大。
为了量化肺部定植，在第22天处死小鼠，并收获肺组织进行大体成像和组织病理学检查。PBS肺表现出密集的肿瘤定植，有32 ± 2.03个转移结节，而nMEL将数量减少到13 ± 1.46个。值得注意的是，nMEL-PBA显示出近乎完全的抑制，只有3 ± 0.71个结节。H&E染色证实了这些发现。一致地，肺重量与转移负荷平行，PBS组平均为0.61 ± 0.06 g，nMEL组为0.30 ± 0.04 g，nMEL-PBA组为0.13 ± 0.01 g，反映了总体肿瘤负荷的显著减少。
nMEL-PBA的显著治疗益处源于两个协同的设计特点。首先，PBA-唾液酸相互作用促进了主动的肿瘤细胞结合，从而增强了瘤内积累，超出了nMEL观察到的被动EPR效应。这种主动识别在被动靶向效率低下的播散性微病灶中尤其有利。其次，肿瘤微环境内的氧化还原响应性二硫键裂解局部恢复了MEL的细胞溶解活性，确保了强大的局部活性而没有全身毒性。这些机制共同解释了nMEL-PBA处理小鼠转移结节减少、肺质量下降和生存期显著延长的原因。总之，这些结果证实，nMEL-PBA不仅能延长生存期，还能有效抑制肺部定植和转移性增殖，代表了克服AMP疗法在转移性癌症中转化障碍的一种有前景的策略。
结论
总而言之，本研究开发了一种氧化还原响应型聚合物纳米胶囊平台，能够在减轻全身毒性的同时实现AMPs的高效肿瘤递送，展示了广泛的转化潜力。以MEL为模型，nMEL的肿瘤积累量比游离MEL高4倍。nMEL在生理条件下保持胶体稳定和惰性，但在肿瘤微环境中经历GSH触发的释放，以恢复细胞溶解活性并实现强大的肿瘤细胞杀伤。在4T1皮下模型中，nMEL将终末肿瘤体积减少至对照组的约20%。为了进一步提高靶向精度，研究人员整合了PBA配体以生成nMEL-PBA，它能结合过表达的肿瘤细胞唾液酸。这种主动设计使肺肿瘤积累比nMEL增加了4.5倍，并在4T1肺转移模型中将中位生存期延长至43天，显著长于nMEL（39天）或PBS（30天）。总之，这些发现确立了nMEL和nMEL-PBA作为安全有效的纳米治疗剂。该平台的模块化使其能够广泛适应于多种AMPs，为推进基于肽的癌症治疗提供了一种变革性策略。
