《Journal of Infection》：The nationwide genomic characteristics and phylogenetic evolution of ST23-K1 hypervirulent
Klebsiella pneumoniae in relation to virulence and antimicrobial resistance acquisition
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针对高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）ST23-K1谱系毒力强且耐药性日益增长的全球性健康威胁，本研究基于全国性流行病学监测数据，通过全基因组测序、毒力表型评估与系统进化分析，全面揭示了中国ST23-K1的基因组特征与进化动态。研究发现，在K1血清型分离株中ST23为最主要的序列型，其有效种群规模在CG23-I亚支系分化后持续增长；荚膜合成（cps）基因座完整性是决定毒力的关键，而高黏液表型（HMV）并非必需；获得性耐药基因（ARGs）在ST23-K1中仍属低流行，其获得可能与携带抗CRISPR（Acr）蛋白的IncFII型质粒相关。该研究为理解hvKp的进化与耐药性传播机制提供了重要数据，强调了持续基因组监测的必要性。
想象一下，一种细菌能够轻易感染健康的年轻人，导致肝脓肿、脑膜炎甚至败血症等严重疾病。这种“超级毒力”的细菌就是高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp），其中ST23-K1谱系在亚洲尤为常见，是引起社区获得性严重感染的主要“元凶”之一。长久以来，这类高毒力菌株对抗生素普遍敏感，使得临床治疗相对容易。然而，近年来警报频频响起：这些原本“毒而不耐”的细菌，开始逐渐获得了抵抗多种抗生素的能力，进化出兼具高毒力和多重耐药性的双重威胁。世界卫生组织和欧洲疾控中心都已发出警告，指出携带碳青霉烯酶基因（如 blaOXA-48）的ST23菌株已在多国出现。这种“强强联合”的进化趋势，无疑将给公共卫生带来巨大挑战。
那么，这种结合了高毒力与潜在耐药性的“危险组合”在中国的情况究竟如何？它的基因组有何特征？是如何进化扩散的？获得耐药性的背后又有哪些“帮凶”？为了回答这些问题，来自浙江大学医学院附属邵逸夫医院感染病科的研究团队，依托一项全国性的流行病学监测项目，对中国境内ST23-K1 hvKp进行了迄今为止规模最大的全基因组测序研究，相关成果发表在《Journal of Infection》上。
为了开展这项研究，研究人员运用了几项关键的技术方法。他们首先从一个全国性监测项目（CHN-CRKP）收集的3415株肺炎克雷伯菌中，筛选出了400株K1血清型分离株。随后，利用全基因组测序技术（包括Illumina短读长和Nanopore长读长测序）对这些菌株进行基因组解析。通过多序列分型、毒力基因和耐药基因分析等生物信息学工具，确定了菌株的分子特征。此外，研究还结合了公开的基因组数据，通过时间尺度的贝叶斯系统发育分析，追溯了ST23-K1在中国的进化历史。在功能验证方面，研究人员使用了经典的拉丝试验和高黏液表型沉淀实验来评估菌株的黏液特性，并采用小鼠腹腔感染模型来直接测定细菌的毒力。
研究结果
中国K1分离株的基因组特征
从全国监测的3415株菌中，共鉴定出400株K1血清型分离株，其中绝大多数为肺炎克雷伯菌（391株）。ST23是其中最流行的序列型，共有343株。这些ST23菌株主要属于克隆群23（CG23）的CG23-I亚支系。分析发现，CG23菌株普遍具有完整的毒力基因谱，但获得性抗菌素耐药基因（ARGs）的携带率较低。
ST23-K1分离株的流行、毒力质粒特征及基于SNP的传播分析
ST23-K1在中国肺炎克雷伯菌中的总流行率为10.0%，但存在地域差异（2.6%至19.6%）。CG23-I亚支系在全国广泛分布。高达94.8%的ST23-K1菌株携带一个类似于pK2044的毒力质粒，该质粒携带有气杆菌素（iuc）、肠菌素（iro）和黏液表型调节基因A（rmpA）等关键毒力基因。通过核心基因组单核苷酸多态性（SNP）分析，研究发现ST23-K1的克隆传播并不常见，仅有7对菌株间的SNP差异小于8个，表明其传播模式可能更为分散。
ST23-K1分离株的高黏液性与毒力
根据拉丝试验，72.6%的ST23-K1菌株表现为高黏液表型（HMV）。然而，小鼠感染实验揭示了一个关键发现：在具有完整荚膜合成（cps）基因座的菌株中，无论拉丝试验是阳性还是阴性，其毒力没有显著差异。相反，携带不完整cps基因座的菌株（如基因突变或插入序列导致）毒力显著降低。600的比较。(B) 按HMV表型和cps基因座完整性分层的三组菌株感染小鼠的生存曲线。(C) 具有不完整cps基因座的菌株中cps基因座的线性比较。">这表明，cps基因座的完整性是决定ST23-K1毒力的核心因素，而HMV表型本身并非毒力的可靠预测指标。
ST23-K1中CRISPR/Cas系统、抗CRISPR蛋白及获得性ARGs的存在
绝大多数（98.0%）ST23-K1菌株携带完整的I-E型CRISPR/Cas系统。在所有携带完整CRISPR/Cas系统的菌株中，发现了一个高度保守的间隔序列（spacer）：CCTGCAGCTGGCCGTCGAGCTGACGGATGCCGG。这个间隔序列对应的原间隔序列（protospacer）频繁出现在携带获得性ARGs的质粒上。研究进一步发现，所有携带获得性ARGs且在原间隔序列阳性的菌株中，都同时存在一种能够抑制I-E型CRISPR/Cas系统活性的抗CRISPR（AcrIE）蛋白。这一发现提示，CRISPR/Cas系统可能构成了ST23-K1获得外源耐药质粒的天然屏障，而质粒携带的Acr蛋白则可能是“突破”这一屏障、促进耐药性获得的“钥匙”。
ST23-K1在中国的抗菌素耐药趋势与有效种群
通过整合本地数据和公共基因组数据，研究分析了ST23-K1在中国的耐药趋势。结果显示，产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的ST23-K1分离株比例随时间推移有所增加，而产碳青霉烯酶的分离株比例则保持相对稳定。系统发育进化分析表明，ST23-K1的有效种群规模自CG23-I亚支系在大约1874年分化后开始持续增长，印证了该谱系在中国持续扩张的进化态势。
质粒组分析揭示ARGs获取的潜在载体
对携带获得性ARGs的ST23-K1菌株的质粒组进行分析发现，这些ARGs主要位于几个特定的质粒组中。值得注意的是，携带原间隔序列和AcrIE蛋白的质粒，绝大多数属于IncFII复制子型。这强烈提示，IncFII型质粒可能与ST23-K1获得抗菌素耐药性密切相关。
研究结论与重要意义
本研究首次在中国范围内基于全基因组测序，系统描绘了高毒力肺炎克雷伯菌ST23-K1谱系的基因组图谱与进化历程。主要结论如下：第一，ST23-K1是中国hvKp的主要流行谱系，其有效种群仍在持续扩张，但直接的院内克隆传播事件有限。第二，决定其高毒力的关键因素是荚膜合成基因座的完整性，而非单纯的高黏液表型。第三，ST23-K1菌株普遍拥有完整的I-E型CRISPR/Cas系统，其中一个高度保守的间隔序列可能通过靶向耐药质粒上的特定序列，构成了限制耐药性获得的天然防线。第四，尽管目前获得性耐药基因在ST23-K1中仍属低流行，但其出现很可能与携带抗CRISPR（AcrIE）蛋白的IncFII型质粒相关，这类质粒可能通过“禁用”宿主的CRISPR免疫系统，从而“护送”耐药基因成功入驻。
这项研究的意义重大。它不仅加深了我们对hvKp这一重要病原体进化生物学和耐药性获得机制的理解，更重要的是，它识别出CRISPR/Cas系统与抗CRISPR蛋白之间的“攻防战”可能是影响hvKp耐药性演变的关键环节。此外，研究强调了仅依靠拉丝试验来判定hvKp的局限性，指出基于基因组的检测方法对于准确评估菌株毒力和进行流行病学监测更为可靠。研究结果提示，未来需要密切关注携带IncFII型质粒（尤其是那些带有Acr基因的质粒）的ST23-K1菌株的传播，因为它们是“毒力”与“耐药”相结合的高风险进化方向。持续的基因组监测对于预警和防控兼具高毒力与多重耐药性的“超级细菌”的出现与传播，具有不可替代的公共卫生价值。
