《British Journal of Pharmacology》：Synergistic RU486 and olaparib therapy enhances apoptosis in endometriosis by simultaneously targeting hormonal signalling and DNA repair
1 引言
子宫内膜异位症是一种慢性、激素依赖性的炎症性疾病，其特征是子宫内膜样腺体和间质在子宫腔外异位种植并发生周期性活动。全球约10%的育龄期女性受此病困扰，其典型表现为进行性加重的痛经、月经过多和不孕，严重影响身心健康。目前的临床管理主要依赖手术干预和药物治疗。然而，手术常伴有子宫肌层和盆腔结构损伤的风险，且复发率高达40%-50%，限制了其在希望保留生育能力女性中的应用。因此，作为一种非侵入性方法，药物治疗已成为长期疾病管理的有前景策略。
米非司酮（RU486）作为一种选择性孕激素受体调节剂，已在多种激素依赖性疾病的治疗中显示出显著疗效。广泛的临床研究表明，RU486通过拮抗孕激素受体有效缓解了子宫内膜异位症患者的疼痛症状。然而，临床上，尽管RU486能显著缓解疼痛，但其在缩小病灶体积方面的疗效有限，且停药后症状常复发。我们近期的研究显示，无论是游离给药还是基于纳米技术的剂型，RU486的病灶抑制率分别仅为25%和37.84%，凸显了RU486单药治疗的局限性。
在寻找更有效治疗策略的过程中，许多研究探讨了子宫内膜异位症的生物学特征。值得注意的是，其类肿瘤行为，即细胞凋亡抵抗和PARP1（Poly(ADP-ribose) polymerase 1）的过表达，导致了异常的DNA损伤反应，这与卵巢癌的分子特征高度相似。关于凋亡抵抗，许多研究表明p53介导的凋亡通路失调可能驱动子宫内膜异位症的进展。RU486在病灶部位有限的治疗效果可能归因于未能充分激活p53介导的凋亡通路。
子宫内膜异位症的第二个特征——PARP1的过表达，为我们提供了另一个潜在的治疗靶点。PARP1是一种DNA修复酶，通过检测DNA链断裂并通过靶蛋白的聚ADP核糖基化促进修复，在碱基切除修复通路中发挥关键作用。PARP抑制剂可阻断此活性，导致DNA损伤积累和细胞死亡，特别是在同源重组修复缺陷的细胞中。临床上，PARP抑制剂主要用于治疗BRCA（乳腺癌易感基因）突变的卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌。值得注意的是，PARP抑制剂诱导的单链DNA断裂可转化为双链DNA断裂，从而放大DNA损伤反应并激活p53通路，这有望增强RU486的促凋亡作用。基于这些不同但可能互补的作用机制，我们提出将PARP抑制剂与RU486联合可能对子宫内膜异位症的治疗产生协同效应。
基于此假设，本研究旨在评估RU486与奥拉帕利联合治疗子宫内膜异位症的效果，并探索其潜在的协同机制。使用原代异位子宫内膜基质细胞评估治疗对细胞毒性、细胞迁移、凋亡、线粒体功能障碍、细胞周期阻滞和DNA损伤等关键病理过程的影响。同时，建立小鼠子宫内膜异位症模型，在体内评估病灶抑制、组织病理学变化和治疗安全性。迄今为止，将RU486与奥拉帕利联合用于子宫内膜异位症治疗的报道很少，这凸显了该治疗策略的新颖性及其临床转化潜力。
2 方法
2.1 材料
实验所用药物与试剂均从商业渠道购得。
2.2 细胞与动物
从子宫内膜异位症患者手术切除的异位病灶中酶解分离得到原代异位子宫内膜基质细胞。所有标本均在获得知情同意后获取，研究方案获得了浙江大学医学院附属妇产科医院伦理委员会的批准。动物研究使用雌性BALB/c小鼠建立子宫内膜异位症模型，所有实验方案均经浙江中医药大学实验动物伦理委员会审查批准。
2.3 细胞毒性与联合指数
使用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法评估细胞毒性。通过SynergyFinder 2.0软件采用零相互作用效力模型评估RU486与奥拉帕利之间的潜在协同、相加或拮抗效应。使用CompuSyn软件计算联合指数。
2.4 Transwell迁移实验与划痕实验
通过Transwell小室迁移实验和划痕愈合实验评估EESCs的迁移能力。
2.5 细胞凋亡检测
使用膜联蛋白V-FITC/PI双染法，通过流式细胞术检测细胞凋亡。
2.6 线粒体膜电位检测
使用JC-1染料，通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测线粒体膜电位变化。
2.7 DNA双链断裂的免疫荧光检测与彗星实验
通过γ-H2AX免疫荧光染色和彗星实验评估药物暴露后的DNA损伤。
2.8 细胞周期分析
通过碘化丙啶染色和流式细胞术分析细胞周期分布。
2.9 蛋白质印迹分析与实时定量逆转录PCR分析
通过蛋白质印迹和RT-qPCR检测凋亡相关蛋白（如p53、Bax、Bcl-2、caspase-3、PARP1、γ-H2AX等）的表达水平。
2.10 子宫内膜异位症小鼠模型的构建与体内治疗
建立小鼠子宫内膜异位症模型。建模成功后，模型小鼠通过口服灌胃给予RU486和奥拉帕利进行治疗，每3天一次，共七次。通过热板试验评估伤害性敏感性，收集异位病灶并记录其数量、体积和重量，通过ELISA检测血清雌二醇和孕酮水平，并通过免疫组织化学和TUNEL免疫荧光分析评估病灶细胞增殖、DNA损伤和凋亡情况。
2.11 体内生物安全性评价
通过血清生化分析和主要器官的组织病理学检查评估治疗的全身安全性。
2.12 统计分析
数据使用GraphPad Prism进行分析，组间比较采用单因素方差分析及Tukey多重比较检验。
3 结果
3.1 体外细胞毒性
根据零相互作用效力模型，RU486与奥拉帕利以约1:4的比例组合时，多个浓度点持续位于协同区域内，表明两种药物之间存在强烈的协同相互作用。在1:4比例下，联合组的IC50值显著低于单药，联合指数分析的所有值均低于1，与强协同效应一致。
3.2 细胞迁移实验
在划痕实验中，所有治疗组在12小时时均显示出比对照组显著降低的迁移率。到24小时，RU486和奥拉帕利单药治疗均显著减少了迁移面积，而联合治疗产生了最显著的抑制效果。Transwell迁移实验结果与此一致，联合治疗组的迁移细胞数量最低。
3.3 体外凋亡研究
流式细胞术分析显示，与对照组相比，RU486和奥拉帕利单药治疗均显著增加了凋亡细胞比例。联合治疗组的凋亡率显著高于任一单药治疗组，表明RU486和奥拉帕利联合显著增强了EESCs的凋亡反应。
3.4 体外线粒体膜电位分析
JC-1染色结果显示，与对照组相比，RU486和奥拉帕利均显著诱导了线粒体膜电位丢失。联合治疗导致了比任一单药治疗更显著的JC-1单体积累，表明其具有更明显的线粒体功能障碍效应。共聚焦显微镜观察进一步证实了这些发现。
3.5 体外DNA损伤分析
彗星实验结果显示，RU486和奥拉帕利单药治疗均显著增加了DNA尾长，表明它们能够诱导DNA链断裂。奥拉帕利诱导的DNA损伤略高于RU486。联合治疗组的尾长进一步增加。γ-H2AX免疫荧光染色显示，RU486处理组的γ-H2AX信号强于对照组，奥拉帕利处理组的信号更强，而联合处理诱导了最强、最广泛的γ-H2AX焦点，表明在联合治疗条件下DNA双链断裂水平显著升高。
3.6 体外细胞周期分析
细胞周期分析显示，对照组细胞在G1、S和G2期的比例分别为62.56%、23.06%和14.73%。RU486治疗显著增加了G1期细胞比例，提示G1/S检查点阻滞。相反，奥拉帕利治疗显著增加了S期和G2期细胞比例，表明存在复制应激和DNA损伤反应激活。联合治疗组与单用奥拉帕利相比，S期细胞群减少，G1期水平部分恢复。
3.7 凋亡相关蛋白和基因表达的影响
蛋白质印迹和RT-qPCR分析表明，作为选择性孕激素受体调节剂，RU486缓解了孕激素受体和糖皮质激素受体对p53通路的抑制。因此，p53在mRNA和蛋白水平上均显著上调。在此基础上，下游线粒体凋亡调节因子也发生显著改变。Bax蛋白和mRNA水平增加，而Bcl-2蛋白显著减少，导致Bax/Bcl-2比值显著升高。RU486强烈激活了caspase-3。这些发现表明RU486通过PR/GR–p53–Bax–线粒体损伤–caspase-3信号轴诱导EESCs凋亡。
蛋白质印迹分析显示EESCs中PARP1高表达。奥拉帕利是一种有效的PARP抑制剂，可阻断单链DNA断裂的修复，促进其在复制过程中转化为双链DNA断裂。未解决的DNA损伤积累反映为γ-H2AX蛋白水平的显著增加。本研究观察到奥拉帕利处理后EESCs中p53蛋白水平显著增加，而其mRNA表达不变。推测这种差异是由于奥拉帕利诱导的双链DNA断裂通过减少其降解来稳定p53蛋白。进一步研究表明，奥拉帕ib介导的p53稳定化增加了促凋亡蛋白Bax的表达，降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并显著提高了Bax/Bcl-2比值。
重要的是，本研究似乎确定了联合疗法疗效增强的潜在机制。具体而言，RU486促进p53的转录激活，而奥拉帕利通过阻止其降解来稳定p53蛋白。在联合治疗组中，p53在蛋白和mRNA水平上的表达均显著高于任一单药治疗组。此外，联合治疗组的Bax/Bcl-2比值也显著高于两个单药组。联合治疗诱导的Bax表达增加促进了其从细胞核向细胞质的易位，导致线粒体功能障碍和随后的caspase-3激活。激活的caspase-3进而介导PARP1的蛋白水解切割，这是细胞凋亡执行阶段的标志性事件。在联合治疗组中，总PARP1表达显著低于其他三组，而切割的PARP1表达显著更高。
总之，这部分研究阐明了两药联合的协同机制。简而言之，RU486拮抗PR/GR信号，从而解除对p53通路的转录抑制，并促进Bax和caspase-3等促凋亡基因的表达，使细胞对凋亡敏感。同时，奥拉帕利抑制PARP活性，阻断单链DNA断裂的修复，随后在复制过程中转化为更具破坏性的双链DNA断裂。这种双链DNA断裂的积累诱导γ-H2AX形成并激活p53轴，从而放大DNA损伤信号并驱动细胞死亡。联合疗法通过这两种不同机制在p53中枢上汇聚而实现协同作用。
3.8 体内镇痛研究
使用热板试验评估疼痛敏感性。基线潜伏期在各组间具有可比性。治疗1周后，所有药物治疗组与对照组相比均表现出反应时间延长。RU486单药治疗产生了强效且持久的镇痛效果，与先前的临床和实验报告一致。虽然奥拉帕利可以通过抑制氧化DNA损伤和小胶质细胞活化来缓解疼痛，但其与RU486联合并未增强镇痛作用，这种缺乏协同作用可能归因于RU486单独用药已足以作用于主要的伤害性通路，从而掩盖了奥拉帕利的药理学贡献。
考虑到性激素在促进疼痛敏化中的关键作用，随后量化了血清孕酮和雌激素水平以评估其潜在贡献。所有治疗组与对照组相比，血清孕酮水平均明显升高。值得注意的是，含有RU486的两组与对照组相比显示出统计学显著差异。同样，只有RU486组和联合组显著降低了血清雌激素水平，而奥拉帕利单药治疗没有显著效果。总体而言，在镇痛研究中，RU486和联合治疗均表现出显著的止痛效果，主要通过拮抗PR/GR受体实现。然而，联合疗法与RU486单药治疗相比并未显示出显著更强的镇痛效果。
3.9 体内病灶抑制分析
关于病灶特征，RU486单药治疗在抑制子宫内膜异位症病灶的数量、体积和重量方面表现出中等能力。然而，与对照组相比，这些差异无统计学显著性。这一发现与之前的报告一致，即尽管RU486具有显著的镇痛效果，但其抑制病灶进展的能力仍然有限。相比之下，奥拉帕利单药治疗导致病灶体积和重量显著减少。结果表明，在减少病灶体积和重量方面，奥拉帕利比RU486更有效。在所有治疗组中，联合疗法表现出最显著的治疗效果，病灶数量、体积和重量均为最低。与奥拉帕利组相比，联合组的所有三个病灶参数均略有降低；与RU486组相比，联合组在控制病灶重量和体积方面表现更优。
免疫组织化学染色显示，奥拉帕利组和联合组中γ-H2AX表达升高，表明DNA损伤增强。这一结果与细胞实验的发现一致，在细胞实验中，奥拉帕利有效上调了γ-H2AX的表达。Ki-67表达在联合组中最低，表明双药治疗有效抑制了细胞增殖，并增强了EESCs对凋亡信号的敏感性。TUNEL免疫荧光进一步证实了所有治疗组的细胞凋亡增加，RU486组和奥拉帕利组的荧光强度均显著升高。值得注意的是，与任一单药治疗相比，联合组在异位病灶内的凋亡信号进一步增强。
总之，RU486和奥拉帕利均能不同程度地独立抑制异位病灶的生长并诱导细胞凋亡。RU486与激素受体相互作用，主要通过两种方式发挥作用：首先，通过调节雌激素和孕酮的表达，改善病灶微环境，有效缓解疼痛；其次，解除对p53的抑制，激活凋亡通路。然而，异位细胞固有的凋亡抵抗性限制了RU486单药治疗的效果。奥拉帕利作为PARP抑制剂，引发单链DNA断裂并进一步加剧双链DNA断裂。这种DNA损伤随后导致p53的激活和稳定化增加。作为肿瘤抑制因子，p53提高了Bax的表达，从而增加了线粒体外膜的通透性。这一作用随后激活了caspase-3，启动了内源性凋亡通路。这一系列事件显著增强了细胞凋亡，从而有效抑制了病灶生长。
联合疗法最大化地发挥了两种药物的独特机制：RU486作为初始触发因子，激活p53表达，并提供启动凋亡机制所需的主要能量，使过程逐渐开始，从而减轻疼痛并提供初步的病灶抑制。相比之下，奥拉帕利充当了加速剂，强力推动p53激活，引导凋亡机制快速而准确地进行，从而迅速推进凋亡过程并显著抑制病灶扩展。
3.10 体内生物安全性
血清生化分析显示，各治疗组之间的ALT、AST和BUN水平无显著差异，表明RU486和奥拉帕利联合使用未引起明显的肝肾功能障碍。心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的器官指数分析也显示各组间无显著差异，进一步支持了治疗方案的整体系统安全性。
尽管药物总体安全性良好，但H&E染色显示几个关键器官存在轻微毒性。在RU486或奥拉帕利单药治疗后，心脏组织出现轻度心肌细胞萎缩和细胞直径减小；肝组织显示轻度水肿和胞浆空泡化；在脾脏中，两种治疗均导致滤泡萎缩、淋巴细胞密度降低和明显的含铁血黄素沉积。在肺中，两种药物均导致明显的组织萎缩、上皮增生和肺泡融合。在肾脏中，观察到轻度水肿，以及肾小管上皮细胞部分疏松。
为了进一步提高该方案的安全性和治疗效果，未来的研究应考虑优化给药方法。例如，改进药物剂型可能有助于减少局部毒性，同时提高生物利用度和靶向特异性。近年来，基于纳米载体的激素递送系统在肿瘤学和妇科应用中都显示出显著优势，不仅提高了治疗效力，还增强了组织选择性和系统安全性。因此，将RU486和奥拉帕利开发成纳米颗粒制剂可能为子宫内膜异位症治疗提供更有效、更安全的方法。此外，我们之前的研究表明，一些药物在阴道给药后在子宫具有首过效应，这意味着其在子宫组织中的特异性分布增加，在全身的分布减少。因此，如果明确RU486和奥拉帕利在子宫具有首过效应，后续研究可以将它们制备成阴道凝胶以减少药物不良反应。
4 讨论
鉴于RU486在消除子宫内膜异位症病灶方面的临床疗效有限，本研究建立了一种双管齐下的治疗策略，RU486和奥拉帕利在p53激活机制上汇聚。RU486通过核受体启动p53的转录唤醒，而奥拉帕利通过PARP抑制诱导的DNA损伤促进功能性过度激活，稳定磷酸化的p53以协调Bax介导的线粒体凋亡。这种协同相互作用建立了一个自我放大的回路，其中RU486介导的转录激活和奥拉帕利诱导的p53翻译后修饰协同增强了caspase-3的激活，导致PARP1切割。随后PARP1的失活进一步增强了奥拉帕利的治疗效果，从而强化了凋亡级联反应。在体外，这种组合有效抑制了细胞活力，诱导了细胞凋亡，破坏了线粒体膜电位，并抑制了细胞迁移。在体内，联合疗法实现了病灶重量77.5%的减少，同时保持了持续的镇痛效果。这些发现突出了RU486与PARP抑制剂联合作为一种有前景且创新的子宫内膜异位症治疗策略。
联合疗法是克服单药治疗局限性的成熟方法。其中，奥拉帕利作为一种临床批准的PARP抑制剂，因其能够放大DNA损伤反应和增强细胞凋亡，已成为各种肿瘤联合方案的关键组成部分。最近的研究证实了这种协同策略在不同癌症中的可行性。鉴于子宫内膜异位症具有异常增殖、侵袭、血管生成和凋亡抵抗等类肿瘤行为，将PARP抑制整合到其治疗中代表了一种合理且可行的策略。因此，RU486-奥拉帕利联合为克服单药治疗的局限性并实现增强的治疗协同作用提供了一种有前景的方法。
根据最新的欧洲人类生殖与胚胎学会和美国妇产科医师学会临床指南，目前子宫内膜异位症的治疗方法主要依赖于激素抑制或手术切除。虽然如RU486等孕激素在缓解疼痛和抑制病灶活动方面显示出疗效，但其长期使用常受到激素相关不良反应的限制，包括月经不调、肾上腺抑制和代谢紊乱。本研究引入了一种机制独特的联合策略，RU486和PARP抑制剂奥拉帕利汇聚于p53通路的激活，将激素受体调节与DNA损伤诱导的凋亡相结合。这种双靶向方法不仅提高了治疗效果，还允许显著降低RU486剂量，从而在保持强效病灶抑制的同时，最大程度地减少内分泌相关副作用。重要的是，RU486和奥拉帕利都是临床批准的药物，具有明确的药代动力学和安全性特征，支持了它们快速临床转化的潜力。
此外，该策略与当前国际指南强调的未来方向一致，即倡导开发非激素依赖性、基于机制的精准疗法用于子宫内膜异位症管理。通过聚焦于核心p53信号枢纽，RU486-奥拉帕利联合例证了这一前瞻性的治疗范式。另外，鉴于相关妇科疾病（如子宫腺肌病、子宫内膜增生和卵巢子宫内膜样癌）在凋亡抵抗和DNA修复失调方面具有共同的分子特征，此处建立的机制框架也可能为子宫内膜异位症本身以外的更广泛应用提供转化见解。总的来说，这些发现支持了一种临床上可行、低剂量、机制引导的治疗方法，它不仅符合当前的管理重点，也为更广泛的p53相关妇科疾病应用铺平了道路。
