《Journal of Molecular Biology》：Importance of riboswitch-regulated genes for
Pseudomonas aeruginosa
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本刊推荐：面对多重耐药细菌（MDR）尤其是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）带来的严峻挑战，开发新型抗菌靶点迫在眉睫。本文聚焦于核糖开关（riboswitch）这一调控基因表达的RNA元件，探讨其作为抗生素靶点的潜力。研究团队通过评估营养受限条件下铜绿假单胞菌核糖开关调控基因的重要性，发现SAH（S-adenosyl-homocysteine）水解酶基因sahH在贫营养条件下的生长不可或缺。进一步的分子机制研究表明，SAH核糖开关能以微摩尔级亲和力结合SAH，引发结构重排并上调sahH的表达。这为在病原体感染（通常处于贫营养环境）条件下，靶向SAH核糖开关开发新型抗生素提供了新策略。
在抗生素与耐药菌的“军备竞赛”中，人类似乎总是慢了一步。多重耐药细菌的崛起，特别是像铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）这样的“超级细菌”，几乎对所有常用抗生素都产生了抵抗力，已成为全球公共卫生的巨大威胁。这种机会性病原体常引发危及生命的慢性感染，尤其在医院环境中，是重症监护病房获得性感染的主要元凶之一。传统的策略是不断开发现有抗生素的新衍生物，但这往往只是“换汤不换药”，反而会筛选出更多的耐药菌株。因此，寻找全新的、能够打破现有耐药机制的抗菌靶点，成为了一条势在必行的突围之路。
核糖开关（riboswitch），一种存在于细菌mRNA非翻译区的精巧RNA结构，为科学家们提供了一种充满希望的思路。它们能够直接感知细胞内的特定代谢物（配体），并随之改变自身的构象，从而像开关一样调控下游基因的表达。想象一下，如果能够设计一种药物，模拟这种代谢物，“骗过”核糖开关，让它永久性地关闭或打开某个关键基因，或许就能精准地“扼住”细菌生存的咽喉。然而，这条道路上的一个核心瓶颈在于：目前已知的、受核糖开关调控且对细菌生存至关重要的基因数量稀少，这极大地限制了可用的药物靶点数量。此外，大多数关于基因必需性的研究都在营养丰富的培养基中进行，这与病原体在人体内感染时所面临的、相对贫瘠的微环境相去甚远。那些在实验室“富养”条件下非必需的基因，在真实的“饥饿”战场上，是否会变得性命攸关呢？
带着这些疑问，由Shirin Jahangirnejad、Jean-Philippe C?té和Daniel A. Lafontaine组成的研究团队，将目光投向了铜绿假单胞菌。他们进行了一项系统性的探索，旨在评估在从贫瘠到丰富的不同营养条件下，铜绿假单胞菌中受核糖开关调控基因的必需性，以期发现更多潜在的治疗靶点。这项研究成果已发表在《Journal of Molecular Biology》上。
为了完成这项研究，作者们主要运用了几项关键技术：首先，他们利用一个预先构建的铜绿假单胞菌PA14转座子突变体文库，该文库包含大量单个基因失活的菌株，用于筛选和评估特定基因在不同条件下的生长表现。其次，通过精心设计的生长曲线实验，在四种营养成分不同的培养基（从简单的M9-葡萄糖到丰富的LB培养基）中，系统地监测了各突变菌株的生长情况。接着，采用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）技术，精确测量了目标基因（如sahH）在不同代谢物处理下的mRNA表达水平变化。最后，为了在分子层面揭示核糖开关的工作机制，研究团队利用in vitro（体外）转录结合RNase H（核糖核酸酶H）酶切分析，实时探测了SAH结合前后，核糖开关新生转录本的结构变化，并测定了其对SAH及其他相关代谢物的结合亲和力（Kswitch值）。
结果
营养贫乏条件下sahH的表达对铜绿假单胞菌至关重要
研究团队从一个包含11株不同核糖开关调控基因失活突变体的文库入手。生长实验表明，在营养丰富的LB培养基中，绝大多数突变菌株，包括涉及腺苷钴胺素（AdoCbl）、氟化物、硫胺素焦磷酸（TPP）代谢的基因突变体，其生长均未受到显著影响。然而，一个突出的例外出现了：编码S-adenosyl-L-homocysteine水解酶的sahH基因失活突变体（ΔsahH）。该突变体在LB中生长良好，但在添加了氨基酸的M9-葡萄糖培养基中生长已大幅减弱，而在最贫瘠的基础M9-葡萄糖培养基中，其生长则被完全抑制。这一发现强烈表明，在营养受限的条件下，sahH基因的表达对于铜绿假单胞菌的存活至关重要。
补充SAM可挽救ΔsahH突变体的生长
sahH编码的酶负责将SAH降解为同型半胱氨酸（homocysteine）。研究者推测，sahH失活会导致SAH在细胞内积累，而SAH是SAM依赖性甲基化酶的强效抑制剂，其堆积会毒害细胞。为了验证这一点，他们在M9-葡萄糖培养基中分别补充了SAM（S-adenosyl-methionine，腺苷甲硫氨酸）或甲硫氨酸（methionine）。结果显示，补充SAM能以浓度依赖的方式部分恢复ΔsahH突变体的生长，而补充甲硫氨酸则无效。这证实了生长抑制确实源于SAH的毒性积累，并且可以通过补充其前体SAM来部分缓解。
SAH感应sahH核糖开关的调控效率
既然sahH如此重要，那么调控它的SAH核糖开关是否高效呢？通过RT-qPCR分析，研究者发现了一个有趣的现象：在添加了SAH或能够促进SAH合成的物质（腺苷+同型半胱氨酸）后，sahH的mRNA水平显著上升（最高可达28倍）。这一结果与通常认为的“核糖开关结合配体后抑制翻译”的模式相反，表明SAH核糖开关在结合SAH后，实际上是上调了sahH的表达。研究者认为，这可能与铜绿假单胞菌中必需的转录终止因子Rho有关，翻译效率低下的mRNA更容易被Rho介导的转录终止所降解，因此mRNA水平与翻译效率呈正相关。
sahH新生转录本在SAH结合时发生结构变化
为了在分子层面验证调控模型，研究者对sahH核糖开关进行了结构分析。他们通过体外转录生成新生RNA链，并利用一系列短的DNA探针进行RNase H酶切实验。结果显示，在SAH存在时，对应于核糖开关P4茎（与“开放”构象相关）和SD序列（Shine-Dalgarno sequence，核糖体结合位点）区域的RNA变得更容易被切割，表明这些区域从双链结构中释放出来，变得更加单链化、可接近。这直接证实了SAH的结合诱导了核糖开关从“关闭”构象（SD序列被隔离）向“开启”构象（SD序列暴露）的结构转换，从而允许翻译起始。
sahH核糖开关以微摩尔级亲和力感应SAH并区分相关类似物
最后，研究者定量测定了核糖开关对SAH及其他代谢物的结合亲和力。RNase H酶切实验的滴定曲线显示，sahH核糖开关对SAH的Kswitch值约为13 μM，处于微摩尔范围。它对结构非常相似的SAM也具有一定的亲和力（Kswitch~37 μM），但对腺苷（adenosine）的亲和力低了约15倍，对同型半胱氨酸则几乎没有检测到结合。这表明该核糖开关能够有效区分其天然配体SAH与细胞内其他相关分子，尽管其特异性相较于某些同源核糖开关而言略低。
讨论与结论
本研究系统性地评估了铜绿假单胞菌核糖开关调控基因在营养受限条件下的重要性，并成功锁定了一个极具潜力的新靶点——SAH核糖开关及其调控的sahH基因。核心结论如下：
- 1.
关键靶点的发现：在测试的多个核糖开关调控基因中，唯有sahH的失活会导致铜绿假单胞菌在贫营养培养基（如M9-葡萄糖）中生长完全停滞，而补充其前体SAM可以挽救这一表型。这表明在模拟体内感染可能遇到的营养受限环境中，SAH代谢通路（特别是其分解代谢）对细菌生存至关重要。
- 2.
调控机制的阐明：研究揭示了铜绿假单胞菌SAH核糖开关独特的上调（activation）调控模式。SAH的结合会引发核糖开关显著的结构重排，暴露出SD序列和起始密码子，从而促进sahH的翻译和mRNA稳定，最终增加SAH水解酶的表达以应对SAH积累带来的毒性。
- 3.
作为药物靶点的潜力评估：该核糖开关能以微摩尔级的合理亲和力结合SAH，并对相关代谢物具有一定的区分能力。这为其作为药物靶点提供了生化基础。针对此类“激活型”核糖开关，可以设计一种化合物，模拟SAH并结合，从而在不需要的时候“强制性”地持续高表达sahH，这可能扰乱细菌精细调控的甲基化代谢平衡，或者结合一种抑制剂来阻断SAH的结合，从而在需要时抑制sahH的表达，同样可能达到抑制细菌在感染微环境下生长的目的。
- 4.
研究范式的意义：这项工作强调，在寻找新的抗生素靶点时，必须考虑基因必需性的环境上下文。在富营养实验室条件下“非必需”的基因，可能在模拟感染的贫营养条件下变为“必需”。这为在更广泛的病原体中，通过类似策略（在生理相关条件下筛选）发现新的核糖开关或其它类型的药物靶点，提供了一个有效的实验框架。
综上所述，这项研究不仅将SAH核糖开关确立为对抗多重耐药铜绿假单胞菌的一个有前景的新型抗生素靶点，更重要的是，它提供了一种通过模拟感染微环境来“挖掘”隐藏靶点的创新思路。它连接了基础的RNA调控机制与紧迫的临床抗菌需求，为未来开发具有全新作用机制的抗菌药物奠定了重要的理论基础和实验依据。
