《Journal of Molecular Biology》：Structural, mechanistic and phylogenetic insights into a freshwater actinorhodopsin
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微生物视紫红质结构信息稀缺，限制了对其能量转换机制的理解。本研究通过冷冻电镜解析了淡水放线菌视紫红质RlActR的高分辨率三维结构，揭示了其五聚体组装、脂质填充中心腔及质子转运关键残基，并通过系统发育分析明确了其进化地位，为理解放线菌视紫红质在生态能量循环中的作用提供了结构基础。
在微生物的世界里，有一类名为“微生物视紫红质”的蛋白质家族，它们遍布于细菌、古菌乃至巨型病毒中，充当着微小的“太阳能电池”。这些蛋白质能够捕捉光能，驱动质子跨膜转运，从而为细胞提供能量，在全球能量循环中扮演着至关重要的角色。其中，放线菌视紫红质是近年新发现的一个亚群，主要存在于非海洋的放线菌中。尽管其生态重要性已被提出，但关于这个家族的高分辨率三维结构信息却一直匮乏，这就像我们只知道一个机器很重要，却从未见过它的内部构造和运作原理。具体到来自淡水放线菌Rhodoluna lacicola的放线菌视紫红质RlActR，其精细结构、如何组装成稳定的复合物、以及其质子转运的分子路径等关键问题，均悬而未决。为了揭开这些谜团，一支研究团队展开了深入探索，并将成果发表在《Journal of Molecular Biology》上。
本研究采用了多项关键实验技术。研究人员首先通过在大肠杆菌中的异源表达系统获得RlActR蛋白，并使用非离子去垢剂Cymal-5从细菌膜中提取纯化。随后，通过尺寸排阻色谱、紫外/可见光吸收光谱和光活性分析对蛋白进行了生化、生物物理及功能表征。最终，利用冷冻电子显微镜和单颗粒三维重构技术，在2.84埃的分辨率下解析了RlActR的三维结构。此外，还运用了基于氨基酸序列的系统发育分析，以及与已知结构的微生物视紫红质进行结构比对的研究方法。
研究结果
1. RlActR的生化学、生物物理学及功能表征
为了进行结构解析，研究团队首先需要获得高纯度且功能完整的RlActR蛋白。他们采用在大肠杆菌中异源过表达的策略，并通过镍亲和层析进行纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE验证显示出高纯度。紫外/可见光吸收光谱显示，其视网膜希夫碱在534纳米处有特征吸收峰，表明视网膜辅因子已正确结合。尺寸排阻色谱分析呈现出一个尖锐的单峰，洗脱体积与五聚体组装一致，证实了样品的高度均一性。更重要的是，将纯化的RlActR重构至脂质体中后，在光照下能够引发显著的囊泡外酸化，产生约1个单位的ΔpH，并且该信号在多个光暗循环中保持稳定，明确证明了RlActR具有外向的光驱动质子泵活性。
2. RlActR的结构与寡聚体组装
利用纯化的蛋白，研究团队通过冷冻电镜解析了RlActR的原子结构，分辨率为2.84埃。结构显示，RlActR单体由七个跨膜α螺旋组成，并围绕一个中心凹陷组装成五聚体，其对称轴垂直于膜平面。每个单体的N端位于细胞外，C端位于细胞内，这是典型的微生物视紫红质拓扑结构。然而，RlActR也展现出一些独特的结构特征：在胞外BC环中没有像古菌细菌视紫红质中那样的反平行β折叠，而是有一个短的α螺旋段；跨膜螺旋C在中部因P98残基而出现扭结，呈弯曲外观；螺旋E在胞质端因G170残基而发生凸起形成扭结；一个前所未有的短双亲性α螺旋段近乎垂直地附着在螺旋G上，并通过盐桥稳定。值得注意的是，在螺旋E和F之间观察到一个侧向开口，位于视网膜β-紫罗酮环附近，这可能有助于从膜环境中摄取视网膜辅因子。
3. RlActR中视网膜希夫碱区域的组织及与典型微生物视紫红质的比较分析
结构清楚地解析了RlActR中视网膜以全反式构象通过希夫碱共价连接在K234残基上。视网膜结合口袋主要由芳香族和疏水残基构成，限制了视网膜的移动并稳定其结合姿态。其中，L100残基对光谱调谐至关重要，其存在与RlActR在534纳米吸收绿光的特性一致。在质子转运通路中，几个关键保守残基被识别：D92被认为是主要的质子受体，其附近的H62在细菌的绿光吸收型蛋白视紫红质中被证明与之形成pH依赖的氢键。在RlActR中，H62与D92之间的供体-受体距离为3.6埃，这与测定结构时所用pH值高于其质子受体pKa（5.6）的条件相符，表明该组对处于未质子化状态。相比之下，古菌的细菌视紫红质在相应位置是甲硫氨酸，无法形成氢键，这与其极低的质子受体pKa（2.6）相关。另一个带负电的残基D230通过与其他残基的相互作用，稳定带正电的希夫碱。
4. 寡聚化界面的蛋白质-蛋白质相互作用
RlActR的五聚体结构通过五个相同的界面稳定，每个界面的平均相互作用面积约为1065平方埃。相互作用主要涉及一个单体的螺旋A与相邻单体的螺旋A'-C'。这些相互作用包括位于脂双层疏水核心内的疏水作用，以及位于胞内、胞外区域的亲水作用（如氢键和盐桥）。其中一个保守的盐桥（E39-R38）在细菌的绿光吸收型蛋白视紫红质中也有对应。但由于两个蛋白序列同源性较低（27.7%），多数界面相互作用并未保守。
5. 寡聚化界面的脂质-蛋白质相互作用
在冷冻电镜密度图中，研究者在单体之间的缝隙以及五聚体中央凹陷处观察到了明确的非蛋白质密度，并被建模为脂质分子。鉴于大肠杆菌内膜中最丰富的磷脂是磷脂酰乙醇胺，因此用其进行建模。这些脂质分子与蛋白质之间同时存在疏水和亲水相互作用。位于外围缝隙的两个脂质分子与两个相邻单体相互作用，而位于中央凹陷的一个脂质分子则与两个相邻单体共享。这些脂质-蛋白质相互作用进一步稳定了RlActR的五聚体组装。
6. 选定的微生物视紫红质与RlActR的系统发育分析和结构比较
为了明确RlActR的进化地位，研究者对具有已知三维结构和已验证光驱动质子泵活性的微生物视紫红质（包括RlActR）进行了系统发育分析。结果显示，分支聚类并不严格与宿主生物的生境类型或系统发育归属相关。RlActR与来自淡水蓝细菌的Gloeobacter视紫红质、来自嗜热菌的热视紫红质以及来自极端嗜盐菌的两种黄视紫红质聚为一支。这表明其生境（淡水）与进化关系没有特定关联。结构比较得出的TM分数也印证了系统发育树所揭示的关系。值得注意的是，尽管来自海洋放线菌的MAR视紫红质与RlActR同属放线菌门，但其TM分数表明两者结构差异显著。
结论与讨论
本研究成功解析了来自淡水放线菌Rhodoluna lacicola的放线菌视紫红质RlActR的高分辨率三维结构。结构揭示RlActR形成一个由蛋白质-蛋白质相互作用以及脂质-蛋白质相互作用共同稳定的五聚体。该结构具有一个脂质填充的中央凹陷和位于单体之间的、面向膜的脂质占据缝隙。研究在分子水平上识别了参与视网膜辅因子结合和质子转运通路的关键功能氨基酸残基，并将视网膜希夫碱区域的组织结构与来自细菌和古菌的两个典型微生物视紫红质进行了详细比较，阐明了其质子受体区域氢键相互作用的特性。系统发育分析和结构比较将RlActR定位在一个独特的质子泵微生物视紫红质分支中，突显了其进化独特性。
这项研究的意义在于，它首次提供了淡水放线菌视紫红质家族的高分辨率结构蓝图，填补了该领域长期存在的知识空白。通过揭示其五聚体组装模式、脂质在稳定复合物中的作用以及保守的质子转运机制，该研究极大地增进了我们对放线菌视紫红质如何在其生态环境中行使功能的理解。这些发现不仅为解释这类蛋白质在微生物能量转换和全球能量循环中的贡献提供了结构基础，也为未来基于微生物视紫红质的合成生物学或生物能源应用研究提供了有价值的参考。
