《Journal of Orthopaedic Translation》：HIF1A transcriptionally activates CDKN1A to drive ferroptosis in skeletal muscle ischaemia-reperfusion injury
编辑推荐：
骨骼肌缺血再灌注损伤机制复杂、治疗手段有限。针对HIF1A是否通过转录激活CDKN1A来驱动铁死亡这一未知问题，本研究通过整合转录组学、CUT&Tag测序及功能验证，揭示了HIF1A-CDKN1A轴通过破坏氧化还原稳态加剧铁死亡的关键机制。靶向该轴为减轻骨骼肌缺血再灌注损伤提供了两个互补的分子切入点，具有重要转化潜力。
在骨科手术、血管外科和创伤救治中，比如肢体再植、骨筋膜室综合征或使用止血带时，骨骼肌常常会经历“缺血再灌注损伤”。简单来说，就是组织先因为缺血“饿着”，恢复供血（再灌注）后反而遭受更严重的打击。这种损伤涉及复杂的氧化还原失衡，传统上认为细胞凋亡、坏死是主因，但针对这些通路的治疗效果却不理想，这表明还有我们没发现的“幕后黑手”在捣乱。
近年来，一种名为“铁死亡”的细胞死亡方式备受关注。它是一种铁依赖的、由脂质过氧化级联反应驱动的调节性细胞死亡，其病理特征与缺血再灌注损伤中的氧化损伤高度吻合。虽然铁死亡已被证明是心、脑、肾等器官缺血再灌注损伤的核心介质，但在骨骼肌中的作用和调控机制却一直是个谜。另一方面，缺氧诱导因子1α (HIF1A)作为细胞适应缺氧的主调控因子，在不同病理背景下对铁死亡的调控表现出“双重人格”：有时促进，有时抑制。在骨骼肌缺血再灌注过程中，HIF1A的动态变化及其与铁死亡通路的关系也扑朔迷离。
一个名为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A (CDKN1A/p21)的蛋白，传统上是细胞周期调控因子，最近也被发现能以非经典方式调控铁死亡。有意思的是，生物信息学分析显示，在多器官缺血再灌注模型中，Cdkn1a基因的表达总是上调的，而且已有研究报道在肿瘤中存在HIF1A直接调控CDKN1A的“轴线”。那么，在缺氧的骨骼肌中，这条轴线是否存在？它是否掌管着细胞对铁死亡的敏感性？能否成为治疗的新靶点？
为了回答这些问题，一篇发表在《Journal of Orthopaedic Translation》上的研究提出了一个大胆的假设：HIF1A通过转录激活CDKN1A来驱动骨骼肌缺血再灌注损伤中的铁死亡。研究人员开展了一项系统性的研究来验证这个假设。
为了开展研究，作者综合运用了体内外模型、多组学分析和临床样本验证。关键技术方法包括：建立了小鼠后肢缺血再灌注模型和C2C12成肌细胞缺氧/复氧模型；进行了整合转录组学和染色质图谱技术测序，以识别关键调控轴；使用了遗传抑制（Hif1a siRNA）和药理抑制（LW6、UC2288、Ferrostatin-1）在体内外进行功能验证；通过染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告基因实验验证了HIF1A对Cdkn1a启动子的直接结合与激活；利用透射电镜、生化检测评估了铁死亡标志（线粒体超微结构、脂质过氧化、关键蛋白表达）；临床相关性则通过12例腘动脉损伤患者的骨骼肌活检样本中HIF1A与CDKN1A的共表达分析来评估。
研究结果层层递进，揭示了完整的分子机制：
3.1. 铁死亡存在于骨骼肌缺血再灌注损伤中，Ferrostatin-1在体内外改善铁死亡和损伤
研究人员首先证实铁死亡确实参与了骨骼肌缺血再灌注损伤。与假手术组相比，缺血再灌注组小鼠的骨骼肌出现纤维紊乱、水肿和炎症细胞浸润，同时伴随谷胱甘肽耗竭，以及丙二醛、活性氧和铁离子水平的升高。透射电镜下可见线粒体膜破裂、嵴 collapse等铁死亡典型特征。关键的是，铁死亡抑制剂Ferrostatin-1的预处理能显著减轻这些组织病理损伤、生化指标异常和线粒体结构破坏。在细胞实验中，缺氧/复氧能诱导C2C12细胞死亡，而这种死亡可被Ferrostatin-1特异性抑制，而非凋亡、自噬或坏死性凋亡的抑制剂，进一步明确了铁死亡的主导作用。
3.2. 整合转录组和生物信息学分析鉴定出骨骼肌缺血再灌注损伤中与铁死亡相关的枢纽基因
为了探寻背后的调控机制，研究者对骨骼肌进行了RNA测序。差异表达基因显著富集在氧化应激、铁离子稳态等通路。基因集富集分析证实铁死亡相关基因在损伤组中整体失调。对铁死亡相关差异基因进行蛋白互作网络分析，发现了一个包含32个基因的高度连接模块，其中HIF1A信号通路显著富集。Hif1a与其他四个基因（Cdkn1a, Timp1, Tlr4, Cybb）被鉴定为枢纽基因，且转录调控网络分析将Hif1a置于中心转录因子的位置。
3.3. 抑制HIF1A改善体内外缺血再灌注诱导的脂质过氧化和铁死亡
功能实验发现，在缺血再灌注或缺氧/复氧条件下，HIF1A蛋白发生明显的核转位。在细胞中使用siRNA敲低Hif1a，或在动物体内使用HIF1A抑制剂LW6，都能有效减轻细胞抑制率、改善氧化还原失衡（恢复GSH，降低MDA、ROS和铁）、保护线粒体结构，并使铁死亡关键蛋白GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）表达上调，ACSL4（酰基辅酶A合成酶长链家族成员4）和PTGS2（前列腺素内过氧化物合酶2）表达下调。这表明抑制HIF1A能缓解铁死亡。
3.4. HIF1A通过调控Cdkn1a的转录来减轻缺氧/复氧诱导的脂质过氧化和铁死亡
那么HIF1A是如何发挥作用的？通过CUT&Tag测序（一种染色质图谱技术）分析HIF1A在全基因组的结合情况，发现其结合峰富集在Cdkn1a的启动子区域。功能实验证实，过表达Hif1a能上调Cdkn1a的表达，而敲低Hif1a则降低其表达。染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告基因实验最终验证，HIF1A直接结合到Cdkn1a启动子的特定位点并激活其转录。关键的拯救实验显示，在敲低Hif1a的同时过表达Cdkn1a，可以逆转因Hif1a敲低带来的抗铁死亡效果，证明CDKN1A是HIF1A下游的关键效应分子。
3.5. HIF1A蛋白水平与人体骨骼肌缺血再灌注损伤中的CDKN1A相关
临床转化方面，对12例腘动脉损伤患者的骨骼肌活检进行免疫组化分析发现，在缺血再灌注损伤的肌肉中，HIF1A和CDKN1A的蛋白表达均显著高于正常对照，并且两者表达水平呈显著正相关。这为小鼠模型中的发现提供了临床证据支持。
3.6. 抑制CDKN1A改善体内外缺血再灌注诱导的脂质过氧化和铁死亡
最后，研究直接靶向CDKN1A。在细胞中敲低Cdkn1a，或在动物体内使用CDKN1A抑制剂UC2288，都能产生与抑制HIF1A类似的保护效果：减轻组织损伤、改善氧化还原指标、调节铁死亡标志蛋白。这进一步确认了CDKN1A在驱动铁死亡中的直接作用。
该研究的结论与讨论部分强调，这项研究首次系统性地阐明，HIF1A通过直接转录激活Cdkn1a来驱动铁死亡，是骨骼肌缺血再灌注损伤中的一个核心调控机制。这条HIF1A-CDKN1A信号轴通过耗竭谷胱甘肽和积累细胞内游离铁，加剧氧化还原应激，从而破坏稳态。这一发现不仅填补了骨骼肌缺血再灌注损伤中程序性细胞死亡调控的知识空白，而且挑战了传统上以凋亡和坏死为主的范式。研究揭示了HIF1A在骨骼肌这一特定情境下扮演了“铁死亡放大器”的角色，而CDKN1A则被发现是铁死亡的新型调节因子，其功能具有环境依赖性。
其重要意义在于转化潜力。靶向HIF1A-CDKN1A轴为减轻骨骼肌缺血再灌注损伤提供了两个互补的、可操作的分子切入点。例如，在骨科手术使用止血带前、血管手术血运重建时，或在进行显微外科游离组织移植时，预先使用HIF1A或CDKN1A抑制剂，可能有助于减轻铁死亡介导的组织损伤，延长安全缺血时间，改善临床预后。尽管研究存在一些局限性，如主要使用雄性动物、临床样本量有限、尚未解析CDKN1A的所有下游效应器等，但它无疑为理解骨骼肌缺血再灌注损伤的分子病理生理学提供了新框架，并为开发针对铁死亡的精准干预策略奠定了坚实的理论基础。
