镁离子通过METTL3介导的RhoA基因m6A甲基化促进成骨分化与椎间融合

《Journal of Orthopaedic Translation》：Magnesium ions facilitate osteogenic differentiation and intervertebral fusion via m6A methylation of RhoA mRNA

为解决镁基植入物降解促进骨再生的表观遗传机制不明的问题，复旦大学华山医院团队开展了镁离子促进成骨分化与椎间融合机制的研究。研究揭示4 mM Mg2+通过上调METTL3，介导RhoA mRNA发生m6A修饰，随后被YTHDF1识别并增强其翻译，从而激活RhoA/ROCK通路，促进体外成骨及体内大鼠尾椎融合。该研究为优化骨科镁基植入物提供了表观遗传框架。

　　

在骨科治疗中，骨缺损的修复与融合是一个关键挑战。理想的解决方案是使用一种既能提供初期力学支撑，又能在愈合过程中逐渐降解并被新生骨替代的植入材料。镁及其合金因其良好的生物相容性和与天然骨相近的力学性能，被视为极具潜力的“下一代”可降解骨科植入材料。当镁在体内降解时，释放出的镁离子(Mg²⁺)已被多项研究证实能促进成骨，但其作用机制，尤其是是否存在表观遗传层面的调控，仍是一个待解的谜团。这就像我们知道一把钥匙能打开一扇门，但并不完全清楚它触动的是门后的哪一套精密锁芯。深入解析Mg²⁺的成骨机制，特别是其是否通过N6-甲基腺苷(m⁶A)这一重要的RNA转录后修饰来调控基因表达，对于优化镁基植入物的设计、避免降解过快或成骨不足等问题，具有重要的理论价值和临床转化前景。

近期，复旦大学华山医院骨科团队在《Journal of Orthopaedic Translation》上发表的一项研究，为我们揭开了镁离子促进成骨背后的表观遗传面纱。研究团队发现，镁离子像一个“表观遗传开关”，通过上调甲基转移酶METTL3，对RhoA基因的mRNA进行m⁶A“标记”，从而激活关键的细胞骨架调控通路，最终驱动成骨分化和椎间融合。

为了揭示这一机制，研究人员综合运用了细胞分子生物学、表观转录组学和小动物模型技术。他们首先在MC3T3-E1前成骨细胞中筛选出促进成骨的最佳Mg²⁺浓度。通过甲基化RNA免疫共沉淀测序(MeRIP-seq)和MeRIP-PCR技术，在全转录组范围内寻找受镁离子影响的m⁶A修饰靶基因。利用基因敲低、过表达和挽救实验等功能验证手段，在细胞层面剖析了METTL3-YTHDF1-RhoA这一轴线的上下游关系。最后，研究构建了大鼠尾椎椎间融合模型，并植入纯镁缓释板，在活体水平评估镁离子处理对骨融合的促进效果以及METTL3或RhoA抑制剂对该过程的干扰作用。

研究结果部分揭示了以下几个关键发现：

3.1. 镁对成骨细胞分化具有阈值效应

研究人员发现，Mg²⁺对MC3T3-E1细胞的成骨效应呈浓度依赖性。浓度为4 mM时，细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性和矿化结节形成能力最强，成骨相关基因（如Col1a1， Runx2， OCN）表达也达到峰值。而当浓度升至16 mM时，这些促骨形成效应被抑制，甚至表现出细胞毒性。这表明镁的促骨作用存在一个狭窄而有效的“治疗窗”。

3.2. Mg²⁺通过上调METTL3增强成骨

机制探索发现，4 mM Mg²⁺处理能显著提高细胞整体的m⁶A甲基化水平，并特异性上调甲基转移酶METTL3的表达，而对其他“书写器”（如METTL14）或“擦除器”（如FTO， ALKBH5）影响不大。过表达METTL3能模拟Mg²⁺的促骨效果，而使用METTL3抑制剂STM2457则能阻断Mg²⁺的促骨作用，证明METTL3是Mg²⁺发挥功能的关键中介。

3.3. 镁通过调控RhoA促进成骨

为了寻找METTL3下游的具体靶基因，研究进行了m⁶A表观转录组芯片分析。通过联合分析m⁶A修饰水平和mRNA表达水平的差异基因，并结合生物信息学分析，RhoA基因脱颖而出。它不仅在镁处理后m⁶A修饰丰度显著增加，其mRNA表达也上调，并且其所在的RhoA/ROCK信号通路在成骨中扮演重要角色。

3.4. 镁通过METTL3/RhoA/ROCK轴促进骨形成

进一步的实验验证了这条轴线。敲低RhoA会抑制Mg²⁺或METTL3过表达引起的成骨基因上调和矿化增强。更重要的是，在敲低METTL3的细胞中，过表达RhoA能够挽救被抑制的成骨表型。这证实了RhoA/ROCK通路位于Mg²⁺-METTL3轴的下游，是将m⁶A修饰信号转化为成骨表型的关键执行者。

3.5. YTHDF1促进m⁶A修饰的RhoA mRNA翻译成蛋白

那么，METTL3催化的m⁶A修饰是如何影响RhoA的呢？研究发现，“阅读器”蛋白YTHDF1能够特异性地结合到RhoA mRNA 3‘非翻译区(3’UTR)的特定m⁶A位点上。这种结合并不影响RhoA mRNA的稳定性，而是通过促进其与翻译核糖体的结合，增强了RhoA蛋白的翻译效率。当YTHDF1的m⁶A结合结构域发生突变后，它便无法再促进RhoA的翻译和后续的成骨。

3.6. & 3.7. 镁通过调控METTL3和RhoA促进大鼠尾椎融合

体内实验有力地支持了细胞层面的发现。在大鼠尾椎融合模型中，植入纯镁板能在局部维持约6 mM的Mg²⁺浓度，并显著加速椎间骨融合过程。显微CT和组织学染色（如H&E， 马松三色， Goldner染色）显示，镁板植入组的新生骨小梁更早形成、更致密、矿化更好。而通过在局部注射METTL3抑制剂(STM2457)或RhoA/ROCK通路抑制剂(Y-27632)，镁的促融合效果被明显削弱。免疫荧光染色也证实，镁板植入局部组织中METTL3， RhoA和成骨关键转录因子Runx2的表达同步上调。

归纳研究结论与讨论部分，本研究的重要意义在于：

本研究系统性地阐明了一条全新的“Mg²⁺-METTL3-m⁶A-RhoA/ROCK”信号轴在调控成骨分化和椎间融合中的作用。具体结论是：适宜浓度（4 mM）的Mg²⁺通过上调甲基转移酶METTL3，提高细胞整体m⁶A修饰水平；METTL3进而催化RhoA mRNA发生m⁶A修饰，修饰后的RhoA mRNA被“阅读器”YTHDF1识别并结合，从而增强其翻译效率，产生更多的RhoA蛋白；活化的RhoA继而激活其下游的ROCK信号通路，最终驱动成骨相关基因表达、细胞骨架重组和基质矿化，促进成骨分化。在动物模型中，镁基植入物通过此轴显著加速了椎间骨融合。

在讨论中，作者将本发现与之前关于METTL3促进成骨的研究联系起来，但强调了本研究的独特性：首次将细胞外微环境离子信号（Mg²⁺）与细胞内的表观转录调控（m⁶A）及细胞骨架力学信号（RhoA/ROCK）串联起来，为理解可降解生物材料的生物学效应提供了新视角。研究也指出了局限性，如未探讨Mg²⁺上调METTL3的具体上游机制（可能与TRPM7等离子通道有关），也未排除其他m⁶A阅读器（如YTHDF2/3）的潜在作用，以及从大鼠模型到临床应用仍需大动物实验验证。

总而言之，这项研究不仅揭示了镁离子促骨作用的深层表观遗传机制，为优化镁基植入物的降解性能和成骨活性提供了精准的分子靶点（如METTL3， RhoA），同时也为通过干预m⁶A-RhoA轴来改善脊柱融合等骨科手术预后提供了创新的理论框架和潜在的药物研发思路。