一种高灵敏度的荧光探针，用于监测药物引起的肝损伤和农药暴露中的羧酯酶活性

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：A highly sensitive fluorescent probe for monitoring of carboxylesterase activity in drug-induced liver injury and pesticide exposure

本研究开发了一种基于ICT机制的新型荧光探针N-OAC，用于高选择性和灵敏检测CES酶活性。实验表明，N-OAC在CES激活时可显著增强585 nm处荧光，斯托克斯位移达145 nm，检测限低至3.42×10^-4 U/mL，并成功应用于监测肝细胞损伤及有机磷农药暴露下的CES活性变化。

　　

Bing Zheng|Ying Zhang|Bing Xue|Na Xiao|Wei Shu|Yongrui He

山东第二医科大学药学院，中国潍坊261053

摘要

羧酸酯酶在药物代谢和解毒过程中起着关键作用，因此迫切需要能够监测病理状态下羧酸酯酶活性的工具。本文开发了一种基于分子内电荷转移（ICT）机制的新型荧光探针N-OAC，用于高选择性和高灵敏度地检测羧酸酯酶。当羧酸酯酶被激活时，N-OAC在585 nm处显示出显著的荧光增强，并伴有145 nm的较大斯托克斯位移，实现了3.42 × 10^?4 U/mL的超灵敏检测限和优异的线性（R² = 0.9986）。质谱（HRMS）和密度泛函理论（DFT）研究共同证实了所提出的机制：羧酸酯酶水解乙酰氧基团，从而重新建立ICT途径并导致荧光恢复。N-OAC对生物干扰物具有出色的选择性，并成功应用于监测HepG2细胞在药物性肝损伤（DILI）和有机磷农药暴露下的羧酸酯酶活性变化。值得注意的是，N-OAC能够可视化APAP损伤的肝组织中NAC对羧酸酯酶的上调作用，为评估DILI的严重程度和治疗效果提供了有前景的工具。

引言

药物性肝损伤（DILI）是一种影响肝功能的严重不良药物反应[1]、[2]、[3]、[4]。尽管其在普通人群中的发病率较低，但DILI占急性肝衰竭病例的大部分，死亡率接近50%[5]。DILI的非特异性临床表现和复杂的表型特征使得早期诊断变得复杂，可能加剧代谢功能障碍[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。羧酸酯酶（CES）是一类普遍存在的代谢酶，在药物代谢和解毒中起着关键作用[11]、[12]、[13]。越来越多的证据表明，羧酸酯酶活性的降低与DILI的发生和发展有关，这使这些酶成为临床评估的宝贵生物标志物[14]、[15]、[16]。值得注意的是，有机磷农药（OPs）已被证明能选择性地抑制体内羧酸酯酶的活性，因此羧酸酯酶活性成为监测农药暴露的敏感指标[17]、[18]、[19]。

目前的羧酸酯酶检测方法包括质谱法、分光光度法和高效液相色谱法[20]、[21]、[22]。然而，这些传统方法受到样品制备时间长的限制，并且缺乏在活体系统中监测羧酸酯酶所需的时间分辨率。基于荧光的传感技术作为一种有吸引力的替代方案，具有操作简单[23]、[24]、[25]、[26]、灵敏度高[27]、[28]、[29]、[30]、分子特异性强[31]、[32]、响应速度快[33]、[34]、无创检测[35]、[36]以及具有生物成像能力[37]、[38]、[39]等优点。近年来，基于分子内电荷转移（ICT）机制的荧光探针已成为监测酶活性的强大工具[8]、[11]。对于羧酸酯酶的检测，经典的ICT探针设计采用了一个推拉电子系统，其中可被羧酸酯酶水解的酯键同时作为识别单元和ICT阻断剂[17]、[19]。水解后，电子供体能力得到恢复，从而产生强烈的ICT效应，导致吸收/发射红移和显著的荧光增强。然而，许多现有的羧酸酯酶ICT探针存在局限性，如斯托克斯位移较小，可能导致自吸收和信号重叠，或在复杂生物环境中的灵敏度不佳。我们设计的N-OAC利用1,4-二甲基吡啶鎓基团作为强电子受体，酚类衍生物作为电子供体，有效解决了这些问题。这种特定的供体-受体对在羧酸酯酶激活时产生较大的斯托克斯位移（145 nm），从而最大限度地减少了自淬灭并提高了生物成像的信号保真度（表S1）。此外，该骨架为合理修饰以优化溶解性、选择性和光学性能提供了精确的结构平台。

在这项研究中，我们报道了基于ICT机制的新型羧酸酯酶特异性荧光探针N-OAC的合理设计和合成。N-OAC具有可被羧酸酯酶水解的乙酰氧基团，既作为识别单元又作为ICT阻断剂，确保了对其他水解酶的高选择性。在羧酸酯酶介导的水解作用下，N-OAC在585 nm处显示出显著的荧光增强，斯托克斯位移达到145 nm，有效解决了传统探针中常见的自吸收和信号重叠问题。我们证明了其在不同药理调节条件下监测活细胞内内源性羧酸酯酶活性的能力。我们使用N-OAC监测了4-乙酰氨基酚（APAP）诱导的DILI的细胞和组织模型中的羧酸酯酶活性。此外，我们还将N-OAC的应用扩展到环境毒理学领域，证明了其能够检测活细胞中有机磷农药敌敌畏对羧酸酯酶活性的抑制作用。

部分内容片段

N-OAC的合成

将1,4-二甲基吡啶鎓碘化物（352 mg，1.5 mmol）和3-氟-4-羟基苯甲醛（210 mg，1.5 mmol）混合放入50 mL圆底烧瓶中。加入10 mL无水乙醇作为溶剂，然后逐滴加入50 μL哌啶。反应混合物在氩气氛围下于90°C下回流16小时。反应完成后，将混合物冷却至室温，然后在冰水浴中搅拌，生成红色产物

N-OAC对羧酸酯酶的光学响应

为了评估N-OAC对羧酸酯酶（来自猪肝）的检测性能，我们首先在PBS（10 mM，pH 7.4）中检测了其吸收和荧光光谱。与0.1 U/mL的羧酸酯酶孵育后，N-OAC的吸收带出现显著的红移（图S4），表明N-OAC的电子结构发生了显著变化。N-OAC本身由于乙酰氧基团的强吸电子性质，完全抑制了ICT过程，导致几乎完全失去荧光

结论

总之，我们设计并合成了具有出色灵敏度（LOD = 3.42 × 10^?4 U/mL）和抗干扰能力的羧酸酯酶特异性荧光探针N-OACN-OAC对潜在干扰物具有优异的选择性，并能够在各种条件下（包括药物诱导和抑制）追踪活细胞中的羧酸酯酶活性变化

CRediT作者贡献声明

Bing Zheng：撰写——原始草稿，验证，方法学。Ying Zhang：可视化，正式分析。Bing Xue：研究，数据管理。Na Xiao：可视化，资源获取。Wei Shu：撰写——审稿与编辑，项目管理，资金获取，概念构思。Yongrui He：撰写——审稿与编辑，资金获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们衷心感谢山东省自然科学基金（ZR2025MS433、ZR2024QB300、ZR2022QB246）的财政支持。