《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Production of Special Fruit Beer With Addition of Cupuassu (Theobroma grandiflorum) Pulp and Prolyl Endopeptidase to Improve Volatile Compounds and Physicochemical Parameters
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本文开创性地探究了在特酿果味啤酒生产中协同添加古布阿苏（Theobroma grandiflorum）果浆与黑曲霉脯氨酰内肽酶（AN-PEP）的可行性，为开发兼具感官吸引力与功能性的新型啤酒提供了科学依据。研究表明，AN-PEP的添加促进了高分子量蛋白质（如麸质）的降解，并可能在风味前体物释放中发挥作用，影响了3-甲基-1-丁醇、芳樟醇和2-苯乙醇等关键挥发性化合物的含量。最终啤酒呈现出以花香、甜香和威士忌类香气为主导的独特风味，同时酒精度较低（2.80% - 3.44% (v/v)），这为手工及可持续果味啤酒的创新生产奠定了技术基础。
引言
啤酒是全球范围内消费最广泛的饮料之一，拥有超过8000年的历史。近年来，随着特种麦芽与啤酒花的涌现、酵母基因工程的发展，以及消费者对新颖感官体验和健康促进日益增长的兴趣，精酿啤酒产量持续攀升。啤酒创新主要有两大趋势：一是功能性啤酒，例如有机啤酒、低卡/低醇/无醇啤酒，以及低麸质或无麸质啤酒（GFB），旨在满足健康消费需求；二是具有特殊感官刺激的啤酒，如通过添加香草、香料和水果等物质来获得独特风味与香气的啤酒。
在功能性啤酒领域，为满足麸质不耐受人群的需求，生产低麸质或无麸质啤酒成为热点。常见策略包括使用无麸质谷物、基因工程移除麸质中的毒性表位、酶处理等。其中，利用黑曲霉脯氨酰内肽酶（AN-PEP）（EC 3.4.21.26）生产无麸质啤酒是一个极具吸引力的选择，因为它符合食品法规，易于融入现有工业流程，且成本较低。
在感官创新领域，果味啤酒细分市场正快速扩张。添加整果或果肉是最常见的方式，既能利用本地原料，又能融入地域风味。古布阿苏是亚马逊地区的一种重要水果，其果肉具有特征性浓郁香气和令人愉悦的酸味，曾被用作小麦果啤的辅料，能降低苦味并改善最终产品的香气。
本研究将两大创新趋势相结合，首次系统探究了在添加古布阿苏果浆的果味啤酒生产中，同时添加商业蛋白酶AN-PEP，以期开发一款兼具降低麸质潜力和特定香气特征的果味啤酒。
材料与方法
1. 实验处理
本研究设计了三种不同的啤酒处理，均添加古布阿苏果浆，区别在于AN-PEP蛋白酶的添加时机：
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A1组：在发酵开始时添加AN-PEP。
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A2组：在成熟开始时添加AN-PEP。
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A3组：不添加AN-PEP，作为对照组。
所有处理均设置三个独立重复。整个酿造过程中，使用了5.5公斤Patagonia Pilsen麦芽、NP cascade酒花和S-04艾尔酵母，并按照特定的糖化程序（48°C 30分钟，63°C 30分钟，72°C 30分钟，78°C 10分钟）进行。古布阿苏果浆在所有啤酒的成熟阶段开始时添加。
2. 理化参数分析
所有啤酒样品均按照美国酿造化学家协会（ASBC）标准方法，对以下参数进行三重测量：pH值、总酸度（TA）、总可溶性固形物（TSS）、色度、酒精度（ABV）和苦味值。色度使用分光光度计在430 nm处测量，并转换为SRM和EBC单位。苦味值通过ASBC Beer–23A方法测定。酒精度通过测量原始比重（OG）和最终比重计算得出。
3. CIELab色度测定
使用台式分光测色仪直接读取CIELab系统的L（亮度）、a（红绿轴）和b*（蓝黄轴）参数，以更精确地描述啤酒颜色。
4. SDS-PAGE电泳
采用Laemmli法进行一维SDS-PAGE电泳，以评估蛋白酶添加对啤酒蛋白质谱的影响。将10 μg蛋白质上样于12% SDS-PAGE凝胶，电泳后用考马斯亮蓝染色观察蛋白条带。
5. 挥发性化合物（VOCs）分析
采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术分析啤酒挥发性成分。首先优化了SPME萃取条件，发现DVB/CAR/PDMS纤维的萃取效率最高。进一步通过中心复合旋转设计优化了萃取温度和时间，确定最佳条件为35°C下萃取30分钟。挥发性化合物的鉴定通过与NIST 11质谱库比对（相似度≥85%）及线性程序升温保留指数（LTPRI）验证完成。
6. 统计分析
对VOCs数据进行单因素方差分析（ANOVA），并采用Tukey检验（p ≤ 0.05）比较组间差异。使用主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）探索不同配方在VOCs上的关系。
结果与讨论
1. 啤酒的理化特性
所生产的啤酒pH值在3.71至3.84之间，呈酸性，这主要归因于古布阿苏果浆的低pH特性（约3–3.68）。较低的pH有助于抑制腐败微生物生长，提高啤酒的微生物稳定性，并可能影响风味感知。
总酸度较高（4.26–5.10 g/L乳酸当量），超过大多数常规啤酒和许多水果啤酒的范围，接近酸啤酒的风格。
色度（EBC值19.15–20.95）表明啤酒呈微深色。
苦味值（IBU）在12.24–18.60之间，属于较轻盈、顺滑的风格。
酒精度较低，在2.80%至3.44% (v/v) 之间。这主要归因于三个因素：较低的初始比重（OG = 10.5 °P）、为保留古布阿苏挥发性成分而仅在低温成熟阶段添加果浆（限制了其糖分的发酵），以及由低pH和低温条件导致的表观发酵度有限（52.38%–64.29%）。其中，A1组因在整个主发酵期都有蛋白酶作用，释放了更多可利用氮，促进了酵母代谢，因此表观发酵度最高。
2. CIELab色度
所有样品的L值较低，表明啤酒色泽较深，与EBC吸收分析结果一致。b坐标均为正值，表明啤酒呈淡黄色调，这与所用麦芽的颜色有关。添加古布阿苏果浆可能导致了L值的降低。各处理间在L, a, b参数上无显著统计学差异。
3. 酶解作用（蛋白质谱分析）
SDS-PAGE电泳结果显示，三种处理均显示出明显的蛋白条带。与对照组（A3）相比，添加了蛋白酶的A1和A2组在高分子量区域（如70–205 kDa）的蛋白条带强度减弱或消失，表明AN-PEP促进了高分子量蛋白质（包括潜在的麸质组分）的降解。A2组（成熟时加酶）的蛋白质谱与A1组（发酵时加酶）及对照组均有所不同，表明加酶时机会影响最终的蛋白质降解图谱。这初步证明了AN-PEP能够有效降解啤酒中的高分子量蛋白质，为生产低麸质啤酒提供了支持。
4. 挥发性化合物（VOCs）分析
4.1 SPME纤维涂层材料选择与条件优化
五种SPME纤维比较显示，DVB/CAR/PDMS纤维对啤酒中挥发性化合物的总萃取面积最大，因此被选定用于后续分析。通过实验设计优化，确定最佳萃取条件为35°C下萃取30分钟。
4.2 啤酒挥发性成分谱
研究共鉴定出大量挥发性化合物，主要包括酯类、醇类、羧酸类、醛类、酮类和萜烯/倍半萜烯类，并提供了其气味描述。
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关键发现：在三种配方中的两种（具体为A1和A3组）中，检测到了较高水平的3-甲基-1-丁醇（威士忌、麦芽味）、芳樟醇（花香、薰衣草味）和2-苯乙醇（蜂蜜、玫瑰味）。这一结果提示，蛋白酶AN-PEP的添加（以及可能存在的其他因素）可能在释放这些关键风味挥发性化合物的前体物中发挥了作用，共同塑造了啤酒最终的花香、甜香和威士忌类香气特征。
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其他成分：啤酒中还含有多种赋予果香（如乙酸异戊酯-香蕉味、丁酸乙酯-苹果味）、青草香、柑橘香（如柠檬烯）和辛辣木质香（如石竹烯）的化合物，共同构成了复杂的香气轮廓。
结论
本研究成功评估了在果味啤酒生产中同时添加古布阿苏果浆和AN-PEP蛋白酶的可行性。结果表明，这种组合是一种可行的生产策略，能够产生一种具有以花香、甜香和威士忌类香气为主导的独特风味特征，且酒精度较低的果味啤酒。SDS-PAGE分析提供了蛋白酶降解高分子量蛋白质（包括可能的麸质组分）的初步证据。此外，蛋白酶添加可能通过影响风味前体物的释放，对特定挥发性风味化合物的形成产生了积极影响。这些发现为手工及可持续果味啤酒的创新生产，特别是开发兼具吸引力感官特性和降低麸质潜力的新产品，奠定了重要的科学和实践基础。
