《Molecular Oncology》：Circular RNA expression landscapes in myelodysplastic neoplasms: Associations with mutational signatures and disease progression
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本文首次通过超深度总RNA测序系统描绘了骨髓增生异常肿瘤（MDS）造血干细胞和祖细胞中的环状RNA（circRNA）表达谱。研究发现，circRNA丰度在MDS患者中普遍上调，与高危特征和白血病进展风险显著相关，并受剪接体突变和细胞增殖/凋亡状态调节。这些发现揭示了circRNA作为MDS病理新层级的潜力，为理解疾病异质性和开发预后标志物提供了新视角。
引言
骨髓增生异常肿瘤（MDS）是一组起源于造血干细胞和祖细胞的异质性恶性肿瘤，其特征是细胞分化受损导致血细胞减少，并可进展为急性髓系白血病。基因突变，特别是影响剪接的基因（如SF3B1, SRSF2, U2AF1）突变，在至少50%的MDS病例中出现。环状RNA是一类通过反向剪接形成的非编码RNA，其表达在癌症中常发生改变。本研究旨在探究MDS中circRNA的表达谱，分析其与突变特征、疾病特征及患者预后的关联。
方法
研究纳入了来自丹麦四个临床中心的71名CCUS、MDS或CMML患者以及8名年龄匹配的健康对照者。通过流式分选获取CD34+骨髓细胞，并进行超深度总RNA测序（平均深度2.8亿条双端读长）。circRNA通过CIRI2和find_circ两个流程联合检测以最小化假阳性。使用DESeq2进行数据标准化和差异表达分析。对患者样本同时进行了包含33个MDS常见突变基因的靶向二代测序。统计分析使用R和GraphPad Prism进行。
结果：circRNA在MDS和CCUS患者的HSPCs中高表达
在患者与对照中共检测到18，235个circRNA。与健康对照组相比，意义未明的克隆性血细胞减少症（CCUS）和MDS患者组中的circRNA丰度（总归一化读数）显著更高。具体而言，高危MDS组的circRNA丰度中位数（62，070）显著高于对照组（32，928），而低危MDS和CMML组的circRNA丰度与对照组无显著差异。支持读长超过5的circRNA数量也显示出相同趋势，表明circRNA的增加是广泛的，而非由少数circRNA驱动。这些发现提示，circRNA表达上调在MDS疾病谱系中普遍存在，并与疾病风险相关。
结果：高circRNA丰度与高危特征及疾病进展风险相关
靶向测序揭示了典型的突变谱，最常见的是TET2、SRSF2、ASXL1、SF3B1和DNMT3A突变。根据总circRNA读数分布将样本分为高、低丰度组。高circRNA丰度组的患者更可能患有原始细胞增多的MDS（MDS-IB），并且IDH2和RUNX1突变频率更高。低circRNA丰度组则富含SF3B1突变。高circRNA丰度与总生存期无关，但与疾病进展风险显著相关。
结果：circRNA丰度与细胞更新标志物呈负相关
“circRNA稀释假说”认为，circRNA稳定但产生效率低，在快速增殖的细胞中会被稀释。本研究检测了与增殖（MKI67、PCNA）和凋亡（BCL2）相关基因的表达。结果显示，MKI67表达与circRNA丰度呈中等程度负相关，而BCL2表达呈正相关。两者的比值BCL2/MKI67与circRNA丰度呈更强的正相关，且在单变量分析中，PCNA、BCL2及BCL2/MKI67比值均与疾病进展风险显著相关。
结果：剪接体突变影响circRNA表达模式
无监督层次聚类分析显示，患者倾向于根据剪接体突变状态聚类，而不依赖于疾病亚型。例如，几乎所有SRSF2突变样本都聚在一起。此外，样品还根据剪接体突变的具体氨基酸改变进行聚类，例如所有SF3B1K700E突变样本（除一例伴有ZRSR2共突变外）聚在一起。
?5 reads in one or more disease subgroup using Pearson clustering (n?=?79). (B) Cluster annotation from panel A supplemented with the specific amino acid changes of mutations of the splicing factors SRSF2, U2AF1, SF3B1, or ZRSR2.">
结果：高circRNA丰度患者具有与先天免疫系统和病毒应答通路相关的独特基因表达谱
基因表达的主成分分析显示，高circRNA丰度样本与低丰度样本在组分上存在分离趋势。差异表达分析发现，高丰度组有613个基因上调和3033个基因下调。对上调基因的基因本体分析显示，其富集于质膜粘附分子、先天免疫和病毒防御通路相关的术语。
结果：circRNA上调在很大程度上独立于同源线性mRNA表达
与健康对照相比，MDS患者中有38个circRNA显著上调，无下调。circRNA表达变化与同源线性mRNA表达变化的相关性较弱。在38个上调的circRNA中，有31个对应的线性转录本表达下调或稳定（倍数变化 < 1.5），另有4个circRNA的表达倍数变化幅度是其线性转录本的两倍以上。这表明circRNA的广泛上调主要不是由其宿主基因表达增加驱动的。
结果：上调的circRNA与AML进展风险增加相关
这38个MDS相关circRNA的表达模式显示出高度的相关性，多数在相同病例中表达最高，而这些病例中有许多后来进展为AML。但circZEB1显示出独特的表达模式，并且对SF3B1突变病例具有高度特异性。在这38个circRNA中，有20个（53%）与AML进展风险显著相关。排除SF3B1突变患者后，其中13个仍保持显著，另有5个获得显著性。circRNA丰度最高（上四分位数）的MDS患者，其3年AML累积发生率为47%，而较低circRNA丰度患者为12%。单个circRNA中，与AML风险关联最强的是circARID1B。随着疾病严重程度（IPSS-M评分）增加，MKI67表达下降而circRNA丰度上升。
结果：高危MDS与独立队列中circRNA丰度增加相关
在一个包含118名伴环状铁粒幼细胞（RS）的MDS患者的独立验证队列中，高危MDS患者的circRNA丰度显著高于低危患者，而低危患者与健康对照无显著差异。与主队列结果一致，MKI67表达与circRNA丰度呈负相关。差异表达分析同样显示MDS患者相对于对照组存在明显的circRNA上调偏倚。
结果：circZEB1在SF3B1突变存在时上调并与较差生存期相关
在RS队列中，circRNA丰度与总生存期无显著关联，但在SF3B1突变患者中，circRNA丰度与总生存期相关。然而，这在多变量分析中不独立于IPSS-M评分。circZEB1是MDS中上调最明显的circRNA之一，其表达同样由SF3B1突变驱动。在SF3B1突变患者中，高水平的circZEB1（上四分位数）与较差的5年总生存期相关，但在校正IPSS-M评分后不具独立性。
讨论
本探索性研究揭示了MDS中circRNA作为转录复杂性的新层面。高circRNA丰度与高危MDS和AML进展相关。circRNA表达的改变可能部分归因于细胞增殖减少和剪接体突变的影响。大多数上调的circRNA其表达变化独立于同源线性基因，提示存在其他调控机制。尽管“circRNA稀释假说”可以部分解释观察到的负相关性，但增殖减少似乎不能完全解释所有circRNA表达变化。此外，与先天免疫基因和细胞更新标志物的相关性倾向于在相同的circRNA中共同出现，而另一些circRNA与这两组基因均无相关性，这暗示了circRNA调控的异质性。剪接体突变似乎与circRNA表达差异有关，并显示出基因和突变位点特异性的效应。
结论
本研究发现circRNA在MDS中普遍上调，其丰度与高危特征、白血病进展风险相关，并受到剪接体突变和细胞增殖/凋亡状态的调节。这些发现支持了circRNA作为MDS生物学机制新层级和潜在生物标志物的进一步研究价值。
