细胞衰老通过IL-1β而非直接衰老上调口腔相关上皮细胞的LCN2表达：机制与衰老免疫研究

《BioFactors》：Impact of Cellular Senescence on LCN2 Expression in Salivary Gland Epithelial Cells and Oral Keratinocytes

本综述揭示了唾液和牙周液中抗菌蛋白LCN2（Lipocalin-2）在衰老过程中升高的新机制。研究发现，尽管老年小鼠唾液及唾液腺、口腔黏膜中LCN2蛋白水平显著升高，但唾液腺上皮细胞和口腔角质形成细胞自身的复制性衰老及DNA损伤诱导的衰老并未上调LCN2及SASP因子（如IL-1β和TNF-α）的表达。相反，衰老过程中积聚的M1型巨噬细胞分泌的IL-1β，才是上调这些上皮细胞LCN2表达的关键旁分泌因子，为理解衰老相关口腔免疫变化提供了新视角。

　　

引言

细胞衰老是由复制应激、氧化应激、DNA损伤等多种内外源刺激诱导的一种应激反应。衰老细胞表现出不可逆的生长停滞、凋亡抵抗以及基因表达的显著变化，包括代谢失调和衰老相关分泌表型（SASP）。SASP主要由核因子κB（NF-κB）等转录因子调控，其分泌的炎性介质是导致衰老相关慢性低度炎症（即“衰老免疫”，Inflammaging）的关键因素，与多种年龄相关疾病密切相关。

Lipocalin-2（LCN2），也称为中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL），是一种由免疫细胞、星形胶质细胞和上皮细胞分泌的糖蛋白。它在唾液和龈沟液中存在，具有抗菌和免疫调节特性。尽管LCN2的表达主要受NF-κB调控，且其浓度在人类和小鼠血清中随年龄增长而升高，但衰老和细胞衰老对唾液腺及口腔黏膜中LCN2表达的具体影响尚不清楚。本研究旨在探讨衰老是否调节小鼠口腔黏膜和唾液腺中的LCN2表达及其在唾液中的浓度。

衰老对小鼠唾液腺、口腔黏膜LCN2表达及唾液LCN2浓度的影响

研究首先在小鼠模型中进行。免疫组织化学染色结果显示，在年轻小鼠的唾液腺中，LCN2低水平表达于浆液性腺泡细胞的基底侧；而在老年小鼠中，LCN2的表达水平和面积均显著增加。在咀嚼黏膜中，LCN2表达于上皮基底层，且不受年龄影响；而在被覆黏膜的基底层，老年小鼠的染色强度高于年轻小鼠。更重要的是，老年小鼠唾液中的LCN2浓度显著高于年轻小鼠。这些结果表明，衰老增加了唾液中的LCN2浓度，这可能归因于其在唾液腺和口腔黏膜中表达的上调。

复制性衰老降低唾液腺上皮细胞和口腔角质形成细胞中的LCN2表达

为了探究细胞衰老本身的影响，研究团队在已建立的鼠唾液腺上皮细胞（MSEC）复制性衰老模型中进行实验。随着传代次数增加，衰老标志物SA-βGal和p16^INK4A的表达均确认增加INK4A蛋白表达随传代增加">。然而，与预期相反，LCN2的基因表达在传代五次后显著下降，且至少到第九代仍未恢复。同时，SASP因子IL-1β和TNF-α的基因表达也随传代而下降。在蛋白水平上，LCN2在传代五次后变得无法检测，而腺泡标志物AQP5的水平保持不变，表明LCN2的减少并非由腺泡细胞数量减少导致，而是其表达下调所致。

在人工常口腔角质形成细胞（HOK）中也观察到了类似现象。随着传代，衰老标志物（如p21^Waf1/Cip1）表达增加，而LCN2蛋白表达则显著下降。这些结果明确表明，复制性衰老下调了这些细胞中的LCN2表达。

DNA损伤诱导的衰老对LCN2表达的影响

研究进一步利用阿霉素（DXR）诱导DNA损伤介导的细胞衰老。在MSEC和HOK中，DXR处理均成功增加了衰老相关标志物（如γH2A.X、p21^Waf1/Cip1）的表达。然而，LCN2在mRNA和蛋白水平的表达均未发生显著变化。这表明，DNA损伤介导的细胞衰老同样不能诱导LCN2的表达。

细胞衰老对cGAS表达的影响及cGAS信号通路诱导LCN2表达的潜力

近期的研究表明，细胞衰老过程中产生的异常胞质DNA片段可作为DNA传感器cGAS（环鸟苷酸-腺苷酸合成酶）的配体，通过cGAS-STING信号通路诱导一系列SASP因子（包括LCN2）的表达。因此，本研究检测了细胞衰老对这些原代细胞中cGAS表达的影响。结果显示，复制性衰老和DNA损伤衰老均显著降低了MSEC和HOK中的cGAS表达。

用cGAS激动剂G3-YSD处理MSEC，能显著增加NF-κB通路下游因子MCP-1的表达和分泌，但未能诱导衰老标志物或LCN2的表达。此外，G3-YSD诱导的IκBα降解和NF-κB活化在传代早期的MSEC中得到证实，但在传代晚期（衰老）细胞中则未出现。这些结果表明，细胞衰老降低了cGAS表达及其介导的信号传导，并且cGAS信号通路并未在这些口腔相关细胞中诱导细胞衰老或LCN2表达。

诱导口腔及唾液腺上皮细胞LCN2表达的候选因子

既然细胞衰老本身不能诱导LCN2，那么衰老个体中LCN2升高的来源是什么？研究团队将目光投向可能产生诱导因子的周围细胞。已知IL-1β和TNF-α等细胞因子能诱导上皮细胞表达LCN2。实验发现，在HOK中，TNF-α（20 ng/mL）刺激能显著增加LCN2的产生，而IL-1β（500 pg/mL）的诱导效果更强，能达到约两倍的增加。另一种SASP因子IL-6则即使在50 ng/mL的高浓度下也不能显著增加LCN2产生。

进一步的剂量实验证实，IL-1β能浓度依赖性地诱导HOK、MSEC以及永生化人唾液腺上皮细胞系（IHSGEC）中LCN2的表达和分泌。更重要的是，即使在传代15次（衰老）的MSEC中，IL-1β依然能有效诱导LCN2的表达。这表明，来自邻近细胞的IL-1β能诱导上皮细胞表达LCN2，且这种诱导在衰老的上皮细胞中依然有效。

衰老过程中口腔黏膜内IL-1β的潜在细胞来源

研究人员最初假设衰老的成纤维细胞可能是IL-1β的来源。尽管反复传代显著增加了人牙龈成纤维细胞（HGF）中衰老标志物的表达，但IL-1β和TNF-α的分泌蛋白水平并未增加，即使使用高浓度cGAS激动剂刺激也是如此。因此，衰老的成纤维细胞并非分泌性IL-1β的主要来源。

考虑到衰老伴随组织中促炎性M1型巨噬细胞的积累，研究团队转而探究M1巨噬细胞是否为IL-1β的来源。用从THP-1细胞分化的M1型巨噬细胞的条件培养基（CM）处理HOK，能显著诱导LCN2在mRNA和蛋白水平的表达。而添加IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra）后，这种诱导作用被浓度依赖性地抑制。这些结果综合表明，在衰老过程中，M1型巨噬细胞（而非衰老的成纤维细胞）是诱导口腔黏膜LCN2产生的IL-1β的可能来源。

讨论与结论

本研究系统地证明了复制性衰老和DNA损伤诱导的衰老均未增加MSEC和HOK中IL-1β、TNF-α或LCN2的表达。这与某些细胞类型中SASP的典型特征不同，提示上皮细胞SASP因子的组成和转录调控存在细胞类型特异性。研究还发现，衰老标志物p16^INK4A的积累可能通过抑制NF-κB信号通路，间接导致了衰老上皮细胞中部分炎性因子表达的下调。

本研究的核心发现是，IL-1β处理能显著增加口腔角质形成细胞和唾液腺上皮细胞中LCN2的表达和分泌，即使在衰老细胞中亦然。而衰老过程中积聚的M1型巨噬细胞是这种IL-1β的关键旁分泌来源。这一发现揭示了衰老个体唾液LCN2水平升高的新机制：并非由于口腔上皮细胞自身的衰老，而是由于衰老微环境中免疫细胞（M1巨噬细胞）的积聚及其分泌的IL-1β所驱动。

此外，LCN2在口腔健康与疾病中扮演复杂角色。它通过竞争细菌铁载体发挥抗菌作用，并能抑制牙周主要病原体牙龈卟啉单胞菌（Pg）的黏附。然而，LCN2也具有促炎或抗炎、趋化等多重功能，其效应取决于浓度、作用时间及受体表达情况。衰老相关的唾液LCN2浓度升高，可能增强口腔的先天抗菌防御，但其长期影响需进一步研究。

总之，本研究阐明衰老通过M1巨噬细胞来源的IL-1β（而非上皮细胞自身的衰老或衰老成纤维细胞的旁分泌作用）上调唾液腺上皮细胞和口腔角质形成细胞中LCN2的表达，从而增加唾液LCN2浓度。这一发现为理解衰老如何影响口腔局部免疫环境和抗菌防御提供了新的机制见解，并为探索年龄相关性口腔疾病防治策略提供了新思路。