《The Lancet Microbe》：Bedaquiline resistance in patients with Xpert MTB/RIF Ultra-tested rifampicin-resistant tuberculosis in the Western Cape, South Africa: a prospective study
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随着贝达喹啉（bedaquiline）在全口服方案中的广泛使用，其耐药性监测成为结核病防控的重要挑战。为解决这一问题，研究人员在南非西开普省开展了一项前瞻性研究，通过对经Xpert MTB/RIF Ultra（Xpert）检测为利福平耐药（rifampicin-resistant, RR）的结核病患者样本进行分析，评估了贝达喹啉耐药性的流行率。研究采用Deeplex Myc-TB靶向二代测序（targeted next-generation sequencing, tNGS）与表型药敏测试（phenotypic drug susceptibility testing, pDST）相结合的方法，发现在基线分离株（baseline isolates）中贝达喹啉耐药率为12%，在纵向分离株（longitudinal isolates）中高达41%。特别是，在既往无结核病史记录的利福平耐药且异烟肼（isoniazid）敏感（RR-isoniazid-susceptible）的患者中也发现了贝达喹啉耐药，提示存在耐药菌株的传播。该研究发表于《柳叶刀-微生物》（The Lancet Microbe）期刊，其结果表明，随着贝达喹啉-普托马尼-利奈唑胺（bedaquiline–pretomanid–linezolid, BPaL）方案的推广，贝达喹啉耐药性可能正在上升，强调了在常规诊疗环境中高效、准确监测贝达喹啉耐药性的紧迫性和重要性，为制定临床决策和国家治疗策略提供了关键证据。
结核病（tuberculosis, TB）是全球性的重大公共卫生挑战，而耐药结核病，特别是利福平耐药（rifampicin-resistant, RR）结核病，使得治疗变得更加困难。贝达喹啉（bedaquiline）作为新一代抗结核药物，自问世以来，为耐药结核病患者带来了新的希望。2019年起，南非开始为大多数利福平耐药结核病患者提供包含贝达喹啉的全口服治疗方案，并在2023年9月正式在全国范围内过渡到为期6个月的贝达喹啉-普托马尼-利奈唑胺（BPaL）方案。然而，随着贝达喹啉的广泛应用，针对它的耐药性问题也逐渐浮出水面。临床耐药性主要由mmpR5基因的变异介导，该基因编码一种外排泵阻遏蛋白。世界卫生组织（WHO）已条件性推荐使用包括Deeplex Myc-TB在内的靶向二代测序（tNGS）检测来加速二线药物敏感性测定。但此前，在常规诊疗环境中，基于未经选择人群的前瞻性研究数据仍然有限。那么，在南非西开普省，随着BPaL方案的推广，利福平耐药结核病患者中贝达喹啉的耐药性究竟如何？在常规工作流程中，快速分子检测工具的准确性又如何？这些问题亟待解答。为此，研究人员开展了一项前瞻性研究，旨在评估贝达喹啉耐药性的流行率，并评估Deeplex Myc-TB tNGS检测相对于复合基因型-表型参考标准的诊断准确性。
本研究主要采用了以下几种关键技术方法：首先，研究在南非西开普省的国家健康实验室服务（National Health Laboratory Service, NHLS）进行，收集了2023年3月30日至2024年1月3日期间，该省经Xpert MTB/RIF Ultra（Xpert）检测诊断为利福平耐药的结核病患者的连续诊断分离株。其次，研究利用Deeplex Myc-TB检测试剂盒（GenoScreen公司），在常规临床工作流程中测试了样本对贝达喹啉和其他抗结核药物的基因型耐药性。对于检测到mmpR5变异的分离株，研究人员从NHLS和斯泰伦博斯大学（Stellenbosch University）获取了表型药敏测试（pDST）信息。此外，对于显示表型耐药但Deeplex未指示mmpR5突变的分离株，还进行了全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）。统计分析采用了χ2检验和Fisher精确检验，并使用复合基因型-表型参考标准来估计贝达喹啉耐药性的流行率以及Deeplex的诊断准确性。
研究结果
样本概况与队列特征
研究期间共评估了701份来自个体患者的痰液沉淀物，其中131份（19%）为培养阴性。在剩余的570株分离株中，Deeplex检测成功对401株（93%）进行了测序。其中，364株（91%）为基线分离株，37株（9%）为纵向分离株（自上次诊断以来的估计中位时间为5.4个月）。患者以男性为主（60%），中位年龄为36岁。在基线分离株中，有148例（41%）有既往结核病史。
贝达喹啉耐药性流行率
根据复合参考标准，在基线分离株中，贝达喹啉耐药性的流行率为12%（45/364；95% CI 9-16）；在纵向分离株中，流行率高达41%（15/37；95% CI 25-58）。仅使用表型数据，相应的估计值分别为15%（42/280）和47%（15/32）。在已知既往无结核病史的患者中，也发现了贝达喹啉耐药病例。
Deeplex Myc-TB检测性能
从DNA提取到测序，完整的靶向NGS工作流程耗时少于5天。对于复合参考标准确定的贝达喹啉耐药分离株，Deeplex识别出mmpR5变异的发生率为：基线分离株中96%（43/45），纵向分离株中87%（13/15）。其中，被Deeplex归类为“未定性”（uncharacterised）的mmpR5基因型变异与表型贝达喹啉耐药的符合率（16/17，94%）与耐药相关变异（37/38，97%）相似（p=0.53）。与贝达喹啉pDST结果相比，Deeplex检测到的变异（结合耐药相关和未定性两种解释）的敏感性为93%（95% CI 83-98），特异性为99%（97-100）。
异质性耐药
根据GenoScreen软件（即mmpR5变异亚群占总数的≤80%），在基因型耐药的分离株中，有19株（33%）检测到贝达喹啉异质性耐药（heteroresistance），其中7株（37%）为低水平异质性耐药（≤20%）。所有低水平贝达喹啉异质性耐药分离株均表现为表型耐药。与利福平或氟喹诺酮类药物相比，贝达喹啉的总体异质性耐药和低水平异质性耐药更为常见。
广泛的耐药谱
在401株来自Xpert检测为利福平耐药的结核病患者分离株中，15株（4%）经Deeplex基因型鉴定为利福平敏感，98株（24%）为利福平耐药且异烟肼敏感，267株（67%）为耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB，定义为对利福平和异烟肼耐药），21株（5%）为广泛耐药结核病（extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB，定义为对利福平、任何氟喹诺酮类药物以及至少贝达喹啉或利奈唑胺之一耐药）。值得注意的是，在98株利福平耐药且异烟肼敏感的分离株中，有9株（9%）是贝达喹啉耐药的。
研究结论与讨论
这项前瞻性研究揭示了在南非西开普省，随着无注射方案过渡和BPaL方案作为标准治疗引入期间，利福平耐药结核病患者中贝达喹啉耐药性呈现出较高的流行率。主要发现包括：
- 1.
贝达喹啉耐药率高于以往报告，基线分离株为12%，纵向分离株高达41%，提示在BPaL方案推广期间耐药性可能正在上升。
- 2.
在既往无已知结核病史记录的利福平耐药且异烟肼敏感患者中也发现了贝达喹啉耐药（占该亚组的9%），这提示可能存在耐药菌株的传播，因为大多数mmpR5基因介导的贝达喹啉耐药相关的适应性代价有限。
- 3.
研究发现，与Xpert检测为利福平耐药的痰液配对的基线痰液沉淀物中，约有五分之一（19%）无法培养出结核分枝杆菌，这表明了分子检测阳性但培养阴性的挑战。
- 4.
mmpR5基因区域的异质性耐药在三分之一的贝达喹啉耐药分离株中被检测到，且比其它药物更为常见，这凸显了分子检测方法识别低水平异质性耐药的重要性。
研究强调了在常规诊疗环境中加强贝达喹啉耐药性监测的迫切性。靶向NGS检测（如Deeplex Myc-TB）能够快速检测贝达喹啉耐药性，为及时的临床和公共卫生干预提供了可能。然而，研究也指出了在常规实验室实施中存在的挑战，例如检测失败率（本研究为7%）以及对低菌量样本处理能力的局限。研究结论认为，无论是否伴有异烟肼或氟喹诺酮类药物耐药，所有利福平耐药结核病患者都应进行贝达喹啉耐药性检测。强化药物耐药性监测工作和开发新的治疗策略，对于保持含贝达喹啉治疗方案的有效性至关重要。
