《LWT》：Thermosonication Suppresses Heat-Stress-Induced Biofilm Enhancement in
Bacillus: Metabolomics Insights into Reduced Contamination Risk Compared with Pasteurization
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常规巴氏杀菌可灭活微生物，但可能增强芽孢杆菌的生物被膜形成能力，从而增加污染风险。研究人员开展了一项比较热超声（TS）与巴氏杀菌处理对芽孢杆菌影响的研究。他们发现，与巴氏杀菌触发的“程序性生物被膜合成”不同，TS通过破坏三羧酸循环引发“代谢危机”，导致能量严重赤字，并上调通用应激调节因子sigB，使细菌转向生存修复而非成膜，从而实现了杀菌与抑制生物被膜的双重效应。这项研究为控制乳制品生产线生物被膜污染提供了代谢靶向的新策略。
当你打开冰箱，取出一瓶宣称“低温保鲜”、“营养丰富”的巴氏奶时，可曾想过，这道看似安全的热处理工序本身，可能正在为一种隐秘的威胁“推波助澜”？在乳制品行业，常规的巴氏杀菌（Pasteurization）一直是保障产品安全、延长货架期的中流砥柱。它通过高温（通常75-90°C）破坏微生物的细胞结构，有效杀灭大部分细菌。然而，一个令人不安的“悖论”逐渐浮出水面：对于自然界中广泛存在、耐热性强且是乳品中常见污染源的芽孢杆菌（Bacillus）而言，这种旨在灭菌的热处理，反而可能“唤醒”其更强的生存本能——形成生物被膜（Biofilm）。
生物被膜是细菌在不利环境下聚集并分泌胞外聚合物（EPS）形成的保护性结构，它像一层坚固的“堡垒”，能显著增强细菌对清洁剂和后续杀菌处理的抵抗力。一旦在生产线设备（如不锈钢管道）表面形成，生物被膜就会成为持续的污染源，不断向流经的乳制品中释放细菌，导致产品腐败变质，甚至引发食品安全问题。更棘手的是，先前研究发现，包括亚抑制浓度抗生素、氧化应激等不利条件，都可能增强细菌的生物被膜形成能力。我们的前期工作也揭示，常规巴氏杀菌处理，竟然能增强某些芽孢杆菌菌株的生物被膜形成能力。这意味着，我们依赖的“灭菌卫士”，可能在无意中“助攻”了污染源的加固。那么，有没有一种方法，既能有效杀菌，又能掐灭这种“应激性增强”的苗头呢？
为了回答这个问题，一项发表于《LWT》的研究将目光投向了热超声（Thermosonication, TS）技术。TS结合了超声波的空化效应（产生瞬时高压冲击波和微射流，直接破坏细胞膜和剥离生物被膜）与热效应，被认为能在较低温度下实现与巴氏杀菌相当甚至更优的灭菌效果，并能更好地保持产品品质。尽管已有研究证实TS对芽孢杆菌及其孢子具有杀灭作用，并能有效清除生物被膜，但其在分子层面如何干扰细菌在热应激后启动的、特别是那些增强生物被膜形成的代谢重编程过程，仍缺乏系统研究。因此，本研究旨在阐明TS抑制芽孢杆菌热应激诱导生物被膜增强的独特机制，并与常规巴氏杀菌进行比较，为开发针对代谢过程的生物被膜控制策略提供理论基础。
研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，从中国山东省大型牧场采集的原料奶中分离出10株芽孢杆菌，并模拟工业乳品加工条件，使用超高温灭菌（UHT）奶作为培养基、304不锈钢片作为粘附基质，比较巴氏杀菌（85°C水浴，75°C保持15秒）与TS处理（20 kHz, 300 W，75°C保持15秒）对生物被膜形成的影响。其次，采用结晶紫染色法定量生物被膜生物量，并结合扫描电子显微镜（SEM）观察生物被膜-乳成分复合体的微观结构。再者，通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测关键生物被膜形成基因（spo0A, tasA, epsA, sinR）和应激反应基因（sigB, gapB）的表达变化。最后，利用非靶向代谢组学（Non-targeted metabolomics）技术，结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，全面解析不同热处理后细菌生物被膜的代谢物谱差异，并通过随机森林分析和Spearman相关性分析，筛选与生物被膜形成相关的关键代谢物，并建立代谢物与基因表达之间的关联。
研究结果
3.1. 巴氏杀菌矛盾地增强了一些芽孢杆菌菌株的生物被膜形成
对十株分离自乳源的芽孢杆菌初步筛选发现，大多数菌株经巴氏杀菌后生物被膜形成能力因热效应而减弱或消失。但出现了两个显著的例外：蜡样芽孢杆菌BC01和枯草芽孢杆菌BS01。与总体趋势相反，这两株菌经巴氏杀菌后，其生物被膜形成能力显著增强，从中等/弱粘附者转变为强粘附者。这种热应激诱导生物被膜增强的悖论现象，揭示了特定芽孢杆菌物种中关键且可能成问题的适应机制。
3.2. 热超声通过改变微观结构缓解乳基质中的生物被膜增强
在模拟真实乳品加工环境（UHT奶，304不锈钢）下，热应激对BC01和BS01菌株的生物被膜增强效应不仅被复现，而且在巴氏杀菌组中更为明显。关键区别在于，TS处理显著减弱了这种增强效应。SEM提供了直接视觉证据。巴氏杀菌后的生物被膜中，胞外聚合物基质发生剧变，将乳蛋白融合成致密的巨型聚集体，包裹了大量细胞和乳蛋白颗粒，形成高度保护性的物理“堡垒”。相反，TS处理后的生物被膜呈现破碎、疏松的微观结构，其胞外聚合物基质虽含有乳蛋白和细胞，但未能形成巴氏杀菌后可见的巨型聚集体，而是保持了更细丝状、多孔的结构。这表明TS处理在初始阶段产生的强烈物理剪切力，可能改变了细菌细胞的生理状态，阻止了它们协调形成致密的保护性胞外聚合物-乳蛋白层。
3.3. 不同热处理后芽孢杆菌孢子疏水性及生物被膜相关基因表达的变化
孢子疏水性分析表明，孢子疏水性增加并非BC01和BS01生物被膜形成的主要驱动力。基因表达分析揭示了两种热处理诱导了截然不同的生存策略。巴氏杀菌持续上调了主调控基因spo0A以及关键的生物被膜基质基因tasA和epsA，同时抑制了它们的转录抑制因子sinR。这明确表明生物被膜基质合成的上调。相反，TS处理引发了明显不同的反应：它显著抑制了“spo0A-tasA-epsA”通路的上调，同时显著上调了通用应激调节因子sigB，并下调了糖酵解基因gapB。这表明在TS和热应激的双重影响下，细胞进行了代谢重编程，优先考虑由sigB介导的即时细胞保护和修复机制，而非耗能的结构化生物被膜基质合成。
3.4. 代谢组学分析揭示不同热处理后芽孢杆菌代谢重编程的差异
非靶向代谢组学分析发现，两种处理导致了差异显著的代谢变化。京都基因与基因组百科全书通路富集分析显示，对于BC01菌株，巴氏杀菌显著改变了16条通路，最显著富集于蛋白质消化吸收和氨酰基转运RNA合成通路；而TS处理改变了20条通路，除蛋白质消化吸收外，ATP结合盒转运蛋白和胆汁分泌通路也显示出最显著的富集。对于BS01菌株，巴氏杀菌显著改变11条通路，最显著的是雷帕霉素机制靶标信号通路和突触小泡循环；而TS处理显著改变20条通路，影响最深的是生物合成过程，包括氨基酸生物合成以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成。
随机森林分析和相关性分析进一步阐明了机制。对于巴氏杀菌，在BC01菌株中，L-谷氨酰胺和组氨酸的耗竭与生物被膜基因（spo0A, tasA, epsA）的表达上调呈显著负相关。在BS01菌株中，精氨酸水平的下调与胞外多糖合成基因epsA的表达呈负相关。这支持了巴氏杀菌通过消耗特定代谢物来激活生物被膜基因网络的“程序性生物被膜合成”策略。
相比之下，TS处理诱导了独特的“代谢危机”途径。在BC01中，TS导致三羧酸循环中间体（顺乌头酸、α-酮戊二酸）显著上调，表明三羧酸循环在中间步骤被阻断。同时，α-酮戊二酸、顺乌头酸的相对丰度与sigB基因表达呈正相关。在BS01中，TS显著上调了顺乌头酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、甲萘醌、尿嘧啶和吲哚。同样，顺乌头酸和α-酮戊二酸与sigB基因表达水平呈正相关。这些变化共同指向由TS引发的能量赤字和氧化磷酸化途径紊乱。
随机森林分析进一步识别了导致两种处理功能差异的关键代谢物。对于BC01，与巴氏杀菌相比，TS处理导致甜菜碱和磷酸显著积累，同时肌苷水平显著降低。甜菜碱和磷酸的相对丰度与sigB表达呈正相关。对于BS01，TS处理导致蔗糖、5‘-核糖-5’-磷酸、棉子糖和花生四烯酸显著上调。蔗糖和5‘-核糖-5’-磷酸的积累与sigB基因表达呈显著正相关。这些代谢变化表明，细菌在TS引发的严重应激下，代谢优先转向SigB介导的通用应激反应，资源被用于细胞修复、合成内源性保护化合物或应对核苷酸合成途径的扰动，同时具有生物被膜抑制活性的代谢物（如棉子糖、花生四烯酸）上调，共同导致生物被膜合成被抑制。
结论与讨论
本研究证实，与巴氏杀菌相反，热超声通过一种根本不同的应激反应机制抑制了芽孢杆菌的生物被膜增强效应。代谢组学和基因表达分析揭示，巴氏杀菌允许细菌通过激活Spo0A采取一种“程序性生物被膜合成”策略，将资源导向构建坚固的保护性基质。而热超声则施加了决定性的“代谢危机”：它破坏中心碳代谢（特别是三羧酸循环），导致关键中间体积累和严重的能量赤字，并引发通用应激调节因子SigB的显著上调。这种代谢状态的剧变迫使细菌将生存策略从“投资建堡”切换为“紧急维修”，优先将资源用于维持细胞基本完整性和修复损伤，从而显著抑制了生物被膜的合成。
这项研究的发现具有多重重要意义。首先，它在机制层面阐明了热超声作为一种替代巴氏杀菌技术的优越性，不仅在于其物理协同热力的即时杀菌和孢子灭活能力，更在于其能够主动干预并阻断有害的细菌应激适应程序，从源头上降低生物被膜形成的风险。这为乳制品行业提供了一种具有“杀菌”和“抑膜”双重效应的创新干预策略。其次，研究通过整合表型观察、基因表达和代谢组学分析，首次系统描绘了不同热处理下芽孢杆菌代谢重编程的差异全景图，将宏观的生物被膜形成能力与微观的代谢通路扰动和基因调控网络紧密联系起来。这种多组学整合的研究范式为理解复杂食品基质中微生物对加工胁迫的响应提供了范例。最后，研究所揭示的“代谢危机”机制，为开发下一代针对代谢的食品微生物控制策略指明了新方向。例如，未来可以探索将热超声与特定代谢佐剂结合，以加剧细菌的能量应激；或者基于这些代谢洞察优化热超声的工艺参数，在保证杀菌效果的同时，最大化其抑制生物被膜形成的潜能，并可能推广至其他食品加工场景或针对其他腐败菌、致病菌的应用中。总之，这项研究不仅解决了一个具体的乳品安全难题，也为通过靶向微生物代谢脆弱性来开发更智能、更高效的食品安全保障技术奠定了重要的科学基础。
