《LWT》：The effect of fungal proteolytic enzymes on myofibrillar proteins in dry-aged beef
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为解决传统食品发酵中真菌作用机制不清的问题，研究人员以干式熟成牛肉中分离的真菌菌株为对象，结合基因组学、转录组学及蛋白质组学分析，揭示了真菌分泌的天冬氨酸内肽酶是影响牛肉蛋白降解的关键酶类，为优化干式熟成工艺提供了新见解。
一块顶级干式熟成牛排，其标志性的坚果、黄油般浓郁风味与鲜嫩多汁的口感，常被归功于时间的魔法。然而，在这看似简单的“静置”过程中，牛肉表面悄然滋生的微生物，尤其是真菌，究竟扮演了何种角色？传统的认知往往将微生物生长视为需要极力避免的风险，但正如手工奶酪的制作依赖特定的“好”霉菌一样，诱导有益的微生物生长，或许正是提升干式熟成牛肉品质的秘诀。在干式熟成牛肉表面，耐冷的毛霉科（Mucoraceae）真菌与子囊菌酵母是主要的真核生物类群，它们的出现被认为是熟成过程正确的标志。尽管如此，微生物的生长与最终产品品质提升之间的确切关联仍然模糊不清，特别是这些真菌如何通过其分泌的酶来影响肉质，仍是一个未被充分理解的“黑箱”。解开这个谜团，对于科学指导干式熟成工艺、稳定提升牛肉品质具有重要价值。
为此，一项发表在《LWT - Food Science and Technology》杂志上的研究，将目光投向了一株从干式熟成牛肉中分离出的毛霉菌（Mucor sp.）菌株KKP 2092p。研究人员旨在系统评估该真菌生物发酵剂的酶学潜力，并阐明其酶如何影响干式熟成过程中牛肉蛋白质的组成变化。通过一种创新的多组学协同分析策略——即将真菌的基因组与转录组数据，与接种真菌的肉中观察到的蛋白质降解模式相结合，研究团队成功地锁定了在干式熟成过程中引起变化的关键真菌酶。这不仅加深了我们对真菌在传统食品发酵中作用的理解，也为开发可控、高效的肉类熟化生物技术提供了新的思路和潜在的酶资源。
为开展此项研究，作者整合运用了多项关键技术方法。首先，进行了干式熟成实验，使用来自5头杂交牛的背最长肌（Longissimus dorsi）样本，在严格控制温度（1.5°C）和湿度（80-90%）的条件下进行为期28天的熟成，并设立接种真菌生物发酵剂组与对照组进行对比。其次，运用了多组学分析技术：对真菌菌株进行了基因组测序、组装与功能注释，以了解其遗传背景；通过转录组实验，分析真菌在添加牛肉提取物的培养基中基因表达的变化，寻找与蛋白酶活性相关的关键基因；同时，利用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）技术，系统地评估了熟成后牛肉样本中肌原纤维蛋白的降解和聚合情况，量化了特定分子量蛋白条带的变化。
研究结果揭示了真菌对牛肉蛋白组成的特异性影响及其潜在的分子机制。
2.1. 肉类熟化与真菌影响
研究发现，接种真菌生物发酵剂KKP 2092p对牛肉的色泽、pH值、肌肉化学组成或丙二醛（脂质氧化指标）含量均无显著影响，肉的pH值（约5.70-5.74）处于内源性蛋白酶（如钙激活蛋白酶和組織蛋白酶）活性的最适范围。尽管剪切力测量显示嫩度有微小但不显著的改善，但SDS-PAGE蛋白质分析揭示了关键差异。与未接种的对照组相比，接种真菌的牛肉样品中，特定低分子量蛋白质（即113.9 kDa、103.5 kDa和18.9 kDa）的相对含量显著增加。这些低分子量蛋白被普遍认为是肌球蛋白重链（MHC）等长链蛋白发生特异性蛋白水解的产物，是肌肉蛋白降解和肉质嫩化的生物标志物。研究还观察到蛋白质降解在牛肉的外层和中心部位存在微小差异，这可能是由于表层水分流失以及表面生长的真菌所分泌的酶更易接触所致。重要的是，研究未观察到高分子量蛋白质聚集体的形成，表明真菌的酶活性并未对肉质完整性产生负面影响。
2.2. 基因组特征
对KKP 2092p菌株的基因组测序与分析揭示了一个有趣的现象：其基因组（约64.2 Mbp）几乎是已报道的黄色毛霉（Mucor flavus）基因组的两倍。深入分析表明，该分离株实际上包含了两个几乎完整的基因组，分别对应于黄色毛霉（Mucor flavus）和美丽卷枝毛霉（Helicostylum pulchrum），暗示该菌株可能经历了全基因组复制或是一个混合培养物。这种遗传物质的重复可能有助于真菌适应多变的环境条件。
2.3. 转录组特征
2.3.1. 在补充肉提取物样品中基因过表达
当真菌在含有牛肉提取物的培养基中生长时，其代谢活动显著增强。转录组分析显示，与线粒体生物合成、糖异生/糖酵解以及寡肽转运相关的基因表达上调，表明真菌正在积极利用肉类底物中的氨基酸和肽作为能量来源。一个编码假设蛋白698（功能类似硫酸盐输出蛋白）的基因表达显著升高，提示真菌在处理肉类中富含的含硫氨基酸（如半胱氨酸、甲硫氨酸）时，需要有效管理细胞内的硫稳态。
2.3.2. 在补充肉提取物样品中蛋白酶的表达
尽管许多上调的蛋白酶主要参与细胞内蛋白质周转和调控，但研究重点聚焦于一组高度表达的天冬氨酸内肽酶（Aspartic endopeptidases）。其中包括saccharopepsin以及其他几个含有典型A1肽酶结构域的基因。特别值得注意的是，其中一些基因（如ENOG503NV4S和ENOG503PD96）所编码的酶，含有FDTGSSD这一微生物凝乳酶（microbial rennet）的特征性基序。这类酶在奶酪制造业中常被用作动物凝乳酶的替代品。牛肉的pH环境（5.70-5.74）恰好处于这类微生物天冬氨酸蛋白酶发挥活性的最适pH范围内。此前研究已证明，来自米黑毛霉（Rhizomucor miehei）的类似A1肽酶在肉类嫩化中表现优异。因此，这些由真菌分泌的、类似于凝乳酶的天冬氨酸内肽酶，极有可能是导致观察到的牛肉蛋白质特异性降解（如产生113.9 kDa、103.5 kDa等片段）的关键酶类。
归纳研究结论与讨论
本研究通过整合基因组、转录组和蛋白质组数据的多组学方法，成功解析了黄色毛霉生物发酵剂KKP 2092p在牛肉干式熟成中的作用机制。主要结论是：真菌的定植改变了牛肉中短链蛋白质的谱图，显著提升了113.9 kDa、103.5 kDa和18.9 kDa蛋白质的水平。这种变化归因于真菌分泌的内肽酶活性，它们将长链蛋白质（如肌球蛋白重链）切割成更小的产物。转录组分析明确指出，一组天冬氨酸内肽酶基因在真菌接触肉类底物时高度表达。这些酶在序列和功能上类似于在奶酪制造中广泛使用的微生物凝乳酶**，它们具有位点特异性的切割能力，能够在改善肉质嫩度的同时，避免过度水解对肉质完整性的破坏。
这项研究的重要意义在于：首先，它首次通过多组学协同分析，将干式熟成过程中观察到的宏观蛋白质变化与微观的真菌特定基因表达直接联系起来，精准地指出了天冬氨酸内肽酶是驱动这一过程的关键酶类，为理解真菌在传统食品发酵中的功能提供了分子水平的证据。其次，研究所用的KKP 2092p菌株具有非致病性、耐低温、易于培养的特点，且其分泌的酶在低温下仍可能保持活性，这使其成为用于低温酶辅助肉类熟化及其他类似生物技术应用的理想候选。最后，该研究不仅深化了对干式熟成这一传统工艺的科学认识，也为未来开发标准化、可调控的肉类熟化生物发酵剂或酶制剂奠定了理论基础，有望推动肉类加工行业向更精准、更高效的方向发展。
