《Materials Chemistry and Physics》：Fabrication and characterization of Chitosan- poly (3-hydroxybutyrate) scaffold as a novel 3D-printed platform for bone tissue engineering application
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本研究通过3D打印技术制备了含10%和20%聚-3-羟基丁酸酯（PHB）的壳聚糖（CS）支架，系统评估了其物理化学及生物学性能。结果显示，20% PHB的CP20支架压缩强度达19.63 MPa，孔隙直径540μm且结构 interconnected，热分析和XRD证实结晶度提升，细胞实验表明其生物相容性和促骨细胞增殖效果最佳。
作者：Atiyeh Sadat Safavi、Saeed Karbasi、Ali poursamar、Reyhaneh Nasr Azadani、Nooshin Haghighipour
伊朗伊斯法罕医科大学先进医学技术学院生物材料与组织工程系
摘要
壳聚糖（CS）是一种天然聚合物，由于其生物相容性、可降解性、骨传导性和固有的抗菌性能，在骨组织工程中得到了广泛研究。然而，支架的有效性受到其材料组成和制造策略的显著影响。在本研究中，使用3D打印技术制备了含有10%和20%聚（3-羟基丁酸）（PHB）的CS基支架。系统地分析了所得结构的物理化学和生物学特性，发现含有20% PHB的配方（CP20）是最佳候选材料。扫描电子显微镜（SEM）显示，CS和CS-PHB支架的孔隙连接良好，平均孔径分别为409.4 ± 48 μm和540.7 ± 59 μm，有利于细胞渗透。机械性能评估表明，CP20的压缩强度比纯CS提高了19.63 MPa。热分析（DSC）和结构分析（XRD）进一步证实了CP20的结晶度提高，而与TPP的交联有助于控制降解过程。生物学评估，包括细胞粘附和活力测试，验证了CS-PHB支架，特别是CP20，为骨组织工程应用提供了有利的环境。
引言
骨组织经常因受到各种机械应力而受损，是仅次于血液移植最多的组织。因此，快速生成骨组织至关重要[1]、[2]。在修复骨缺损的方法中，自体移植是最可靠的方法。患者自身的骨组织具有生物相容性，能自然促进骨形成、骨传导和骨诱导，同时避免了免疫排斥的风险。然而，尽管自体移植具有显著的生物学优势，但也存在主要限制，如供体骨的有限性、组织分离部位的损伤、移植组织的限制以及免疫系统的反应。为了克服这些缺点，组织工程被认为是修复大范围骨缺损的有前景的方法[3]。骨组织工程（BTE）是一个快速发展的领域，在改善骨修复、再生和定制骨科疗法方面具有巨大潜力[4]、[5]。
组织工程最重要的目标是设计并构建适合目标组织的理想支架[6]。支架为组织提供物理支撑，并创造适合细胞粘附、迁移、增殖和分化的条件。理想的支架应具有多孔结构，以改善营养物质的传输并促进细胞迁移[7]。然而，在支架设计时必须考虑支架的机械强度应与目标组织相匹配[8]。支架的降解速率也应适合组织再生。对于BTE而言，支架的另一个重要特性是它们诱导和促进骨形成的能力[9]、[10]。BTE采用多种技术和材料来设计和制造适合因疾病或损伤而缺失的骨组织的支架。不同的方法，包括电纺[11]、[12]、[13]、冷冻干燥[14]、气体发泡和盐浸[15]，都被用于支架的制造和设计，每种方法都有其特定的优势。然而，控制支架的孔径、孔隙率、孔隙连通性和外部几何形状仍然是一个挑战。目前，3D打印（增材制造）作为一种创新技术被广泛使用，它能够逐层设计支架，从而精确控制均匀孔隙的尺寸和内外几何形状[6]、[16]、[17]。3D打印促进了具有可调机械、化学和生物学特性的支架的发展和制造。这种快速原型制作能力缩短了开发时间，并有助于针对特定应用改进支架设计[7]、[18]、[19]。3D打印可以通过多种方法实现，其中立体光刻（SLA）、熔融沉积建模（FDM）[20]和直接墨水书写（DIW）[22]是最常用的方法之一。3D打印DIW技术因其能够快速、精确且可扩展地制造多种材料和功能而受到广泛关注，这对组织工程和先进制造应用特别有价值[23]。
除了构建方法外，选择合适的材料对于制造理想的支架也是必不可少的[24]。选择合适的材料是组织工程中的关键因素，它会影响最终支架的特性及其在特定应用中的表现。理想的骨再生支架应具备以下特征：生物相容性以减少炎症、可控的生物降解性且副产物无毒、适当的孔隙率以促进血管化和细胞迁移，以及具有与天然细胞外基质（ECM）相似机械特性的三维结构[25]。使用结合天然和合成聚合物的混合支架是一种有效的方法，可以结合每种材料的优势类型。这样的组合可以提高机械强度、控制降解行为、促进细胞增殖并提高支架的生物相容性[24]、[26]。由于壳聚糖（CS）具有广泛的生物功能，已被应用于从硬组织到软组织修复的各种组织工程应用中[27]。
CS是一种线性聚合物，由D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-葡萄糖胺单元以随机顺序排列组成，分别代表去乙酰化和乙酰化成分[28]。CS是一种亲水性、生物相容性、带正电荷的多聚阳离子和抗菌生物聚合物，能增强细胞粘附、增殖和分化。其正电荷使其能够与细胞外基质中的负电荷成分（如糖胺聚糖（GAGs）发生静电相互作用。CS还可以通过与其他细胞因子和生长因子的相互作用来调节细胞行为[29]。最近的研究表明，在3D打印基于CS的支架方面取得了显著进展，这些支架具有精确的几何形状和多孔结构，从而提高了生物相容性、细胞粘附、增殖和分化[30]、[31]。
Mohandesnezhad等人[32]开发了一种由CS/藻酸盐/硬石膏石（CS/Alg/HD）组成的支架，用于潜在的BTE应用。在这项研究中，HD粉末以四种浓度（0%、40%、55%和70%）合成并加入到CS/Alg基质中。随后使用直接墨水书写3D打印方法将这些复合材料加工成结构良好的多孔支架并进行了表征。结果表明，CSAlg-HD70具有最高的屈服强度（1.38 MPa）和弹性模量（125.71 MPa），以及最高的降解率和生物活性。此外，结果显示HD颗粒的存在增强了细胞活力和附着能力，例如在CSAlg-HD40中，暴露于支架提取物中的MG-63细胞在第七天的存活率达到了150%。总之，这些发现验证了由CS/Alg和HD组成的支架是BTE的有希望的候选材料[32]。
尽管CS具有有益的特性，但其机械强度不足且在生理环境中降解较快。因此，提高CS在组织再生中应用性的一个可行方法是将其与其他聚合物结合[30]。Morris等人[33]评估了由CS和合成聚合物聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）组成的混合支架的机械性能和细胞相容性。CS的分子量和进料比例影响了支架的特性和打印精度。最佳的PEGDA-CS进料比例为1:5–1:10。由于低分子量CS（LMWC）的去乙酰化程度较高，需要更多的醋酸钠来中和其质子化的氨基。他们使用SLA技术制备了具有优越打印性的支架，比例为1:7.5。SLA可以根据患者解剖结构有效调节支架的组成和孔隙结构。他们使用405纳米激光制备了耳形支架。树脂配方中增加的CS含量提高了复合材料的膨胀率。由于其机械性能和细胞粘附及增殖潜力，该支架有望用于制造具有复杂几何形状的软骨组织。另一种可以有效改善CS性能的聚合物是聚（3-羟基丁酸）（PHB）[34]、[35]。PHB属于聚羟基烷酸家族，是一种在组织工程应用中备受关注的生物聚合物。PHB及其变体因其与人体组织的天然生物相容性而受到认可。此外，由于其在生理环境中的缓慢降解速率，PHB可以提供坚固的临时支撑结构，而不会在植入部位积累酸性副产物。显著的拉伸强度和柔韧性对于提高含PHB支架在承受较大应力下的稳定性至关重要[36]。
CS-PHB支架结合了CS的有利生物特性和PHB的机械强度，使其成为组织工程研究的重点[37]、[38]、[39]。最近的研究探讨了CS的生物活性特性与PHB提供的结构增强之间的潜力。然而，仍需继续研究以解决机械强度、成分均匀性和调控降解等问题，以优化其临床应用[40]。
本研究探讨了使用CS和PHB组合进行3D打印这一先前未探索的主题。本研究旨在通过DIW 3D打印技术制备用于骨再生的CS基支架。研究了PHB对墨水可打印性的影响，以及其对支架微观结构、亲水性、机械特性、降解速率和生物学评估的影响。
材料
本研究使用的材料总结见表1。
3D打印支架的制备
制定合适墨水的初始阶段包括选择CS-PHB的常用溶剂。选择纯甲酸作为CS-PHB生产的环保替代溶剂[41]。随后，将15%的CS溶解在甲酸中，并将溶液置于37°C的培养箱中过夜。获得均匀的CS溶液后，再加入10%和20%浓度的PHB溶液
扫描电子显微镜（SEM）
图2(A-F)展示了C、CP10和CP20 3D打印支架的形态。所有支架都由均匀的纤维和相互连接的多孔结构组成。C、CP10和CP20的纤维平均宽度约为400 μm，孔径范围为500 μm。详细信息已在表4中给出。C样品的纤维直径为（420±20）μm，CP20为（406±40）μm。SEM分析显示
结论
本研究使用DIW方法（一种基于挤出的3D打印技术）设计和制备了CS-PHB 3D打印支架。结果表明，添加PHB后，接触角降至58.34° ± 0.08，机械强度提高到19.63 ± 1.2 MPa。SEM图像显示支架具有规则且相互连接的孔隙结构，这是组织工程支架的重要特性。最佳孔径为540 μm，孔隙率为81%。
CRediT作者贡献声明
Saeed Karbasi：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、资源提供、数据分析、概念构思。Atiyeh Sadat Safavi：撰写 – 初稿撰写、资源提供、调查、数据分析、概念构思。Reyhaneh Nasr Azadani：调查。Ali poursamar：可视化、方法学。Nooshin Haghighipour：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
伦理批准
本研究已获得伊斯法罕医科大学和卫生服务研究伦理委员会的批准，批准编号为IR.MUI.REC.1402.020
关于写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本手稿期间，作者使用了Grammarly和Paperpal工具进行文本编辑。使用这些工具后，作者根据需要审查和修改了内容，并对出版物的内容负全责。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究是博士论文的一部分，得到了伊斯法罕医科大学的资助（资助编号：59560）。作者衷心感谢伊朗巴斯德研究所的国家细胞银行提供的宝贵技术支持和资源（资助编号：2265）。作者还强调，这项研究得益于理事会的一项高度认可的奖项
