《European Journal of Immunology》：IL-21 Selectively Augments Cytotoxic Potential of Antigen-Activated MAIT Cells
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本研究发现，白细胞介素-21（IL-21）作为一种新型共刺激因子，能选择性地增强经T细胞受体（TCR）或IL-12/IL-18激活的黏膜相关恒定T细胞（MAIT cell）的颗粒酶B（granzyme B, GrzB）和穿孔素（perforin）的表达，进而提升其特异性杀伤5-OP-RU处理的B细胞靶标的能力。这一发现揭示了IL-21在调控MAIT细胞效应功能中的特异性作用，为针对MAIT细胞的免疫疗法提供了新的思路。
1 引言
黏膜相关恒定T细胞（Mucosal-associated invariant T cells, MAIT cells）是一类丰富的非传统T细胞群，富集于肠道、肺部、女性生殖道黏膜和口腔黏膜等部位，在肝脏中可占T细胞总量的20%–50%，在外周血中占T细胞的1%–10%。MAIT细胞的特征是表达一个αβ T细胞受体，该受体由一个半不变的α链（Vα7.2-Jα33/12/20）和有限的β链（在人类中最常见的是Vβ2/Vβ13）组成。它们受到主要组织相容性复合体I类相关分子（MHC-class 1 related molecule, MR1）的限制，能够识别来自微生物核黄素合成的保守嘧啶衍生物，即5-(2-氧代丙叉基氨基)-6-D-核糖基氨基尿嘧啶（5-OP-RU）。激活的MAIT细胞会上调干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α和/或白细胞介素（IL）-17A，并产生细胞毒性分子来裂解细菌感染的细胞。静止的MAIT细胞表达高水平的颗粒酶（granzyme, Grz）A、GrzK和GrzM，但GrzB、穿孔素和颗粒溶素的水平很低或可忽略不计。GrzB和穿孔素在激活的MAIT细胞中显著上调，并可作为MAIT细胞细胞毒性潜能的指标。细胞因子可以作为共刺激分子增强MAIT细胞的激活，但它们调节MAIT细胞细胞毒性的具体作用仍未明确。
白细胞介素-21（Interleukin-21, IL-21）主要由激活的CD4+T细胞【特别是滤泡辅助T细胞（Tfh）和辅助性T细胞17（Th17）】和iNKT细胞产生。IL-21主要通过Janus激酶（JAK）-信号转导与转录激活因子（STAT）途径发出信号。研究表明，MAIT细胞表达IL-21受体（IL-21R），并且IL-21可以激活MAIT细胞中的STAT3。然而，IL-21是否直接调节MAIT细胞的细胞毒性功能尚未得到证实。本研究旨在探究IL-21在调控MAIT细胞细胞毒性方面的作用。
2 材料与方法
研究使用从外周血中分离的人外周血单个核细胞，并通过流式细胞术、LEGENDplex多重细胞因子检测和基于流式细胞术的细胞毒性试验等方法进行了一系列体外实验。MAIT细胞被定义为表达TCR Vα7.2和高表达CD161。实验使用了MR1配体5-OP-RU、大肠杆菌（E. coli）HB101、抗CD3/CD28抗体磁珠以及包括IL-21在内的多种细胞因子进行刺激。
3 结果
3.1 IL-21增强TCR依赖性MAIT细胞的细胞毒性潜能
研究首先确认了MAIT细胞表达IL-21R。RNA测序数据显示，与静息MAIT细胞相比，经5-A-RU或大肠杆菌刺激的MAIT细胞，其IL21R基因表达显著上调。然而，在蛋白水平上，尽管B细胞作为阳性对照清晰地表达了IL-21R，但在未刺激或TCR激活的MAIT细胞表面未观察到明确的IL-21R染色。
将外周血单个核细胞与IL-21、5-OP-RU以及抗MR1抗体共同孵育6小时后，IL-21单独处理即可显著增强MAIT细胞的穿孔素表达，但对其他标记物影响甚微。在5-OP-RU激活的MAIT细胞中，IL-21进一步增强了CD69、CD107a和GrzB的表达，但没有影响5-OP-RU诱导的GrzA下调。IL-21对FasL和颗粒溶素的表达也没有明显的上调作用。这种IL-21介导的对穿孔素和GrzB表达的增强作用可以被抗IL-21R抗体完全抑制。
有趣的是，IL-21在6小时的时间点上对MAIT细胞的细胞因子（IFN-γ、TNF-α或IL-17A）产生影响甚微。
为了确定IL-21是否直接作用于MAIT细胞，研究使用了磁珠分选的Vα7.2+细胞。结果显示，与单独使用抗CD3/CD28刺激相比，IL-21 + 抗CD3/CD28显著增加了表达GrzB的MAIT细胞的百分比。然而，在细胞培养上清液中仅检测到GrzB浓度的轻微、非显著性增加，并且未观察到IL-21引起的穿孔素上调。这表明IL-21对穿孔素的上调作用可能是间接的，依赖于其他免疫细胞的存在。此外，IL-21下调了抗CD3/CD28刺激的Vα7.2+细胞的IL-2和TNF-α产生，但不影响IFN-γ和IL-17A。
3.2 IL-21增强TCR非依赖性MAIT细胞的细胞毒性潜能
研究进一步观察了IL-21对MAIT细胞作用的时间依赖性。单独使用IL-21处理外周血单个核细胞长达72小时，发现穿孔素表达在6小时达到峰值后下降，而GrzB表达在48小时内持续增加，GrzA和颗粒溶素表达在72小时内增加。这表明IL-21对MAIT细胞不同细胞毒性分子的调控具有时间依赖性。
鉴于IL-21的时间依赖性效应，研究探究了IL-21是否能增强由IL-12和IL-18介导的TCR非依赖性MAIT细胞激活。将外周血单个核细胞与IL-21和IL-12/IL-18组合处理24小时，结果显示，在没有IL-12/IL-18共刺激的情况下，IL-21对CD69、CD107a、FasL或GrzA的表达没有影响，但显著增强了GrzB的表达，对穿孔素的影响则较温和。当与IL-12/IL-18组合时，IL-21进一步上调了所有细胞毒性标志物的表达。这表明IL-21也能增强由细胞因子激活的MAIT细胞的细胞毒性潜能。
3.3 IL-21与其他细胞因子对MAIT细胞TCR反应的叠加效应
研究还评估了IL-21与I型干扰素或IL-2、IL-7、IL-15等其他共刺激细胞因子的联合作用。当IL-21与亚最适浓度的IFN-α或IFN-β，或与IL-2、IL-7、IL-15组合时，对MAIT细胞GrzB的产生表现出叠加效应。IL-21本身就能诱导MAIT细胞细胞毒性分子的表达，并能与其他共刺激细胞因子协同作用，增强早期TCR介导的MAIT细胞GrzB的产生。
3.4 Blimp-1和pSTAT3的表达被IL-21上调
研究探讨了IL-21影响MAIT细胞的潜在机制。IL-21和5-OP-RU联合处理显著增强了MAIT细胞中Blimp-1的荧光强度中值，而单独IL-21处理会导致T-bet的荧光强度中值轻微下降。此外，IL-21和IFN-α均能显著诱导MAIT细胞中STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化，其中IL-21对pSTAT3的上调作用最强。这种STAT蛋白的磷酸化可被抗IL-21R抗体抑制。
3.5 大肠杆菌刺激的MAIT细胞表达GrzB涉及IL-21信号
为了探究IL-21在MAIT细胞对生理性刺激（如细菌）反应中的作用，研究在使用大肠杆菌刺激外周血单个核细胞的同时，加入了抗IL-21R抗体。结果显示，阻断IL-21R会显著降低经大肠杆菌处理的MAIT细胞的GrzB表达，并对穿孔素表达有轻微的降低作用。然而，阻断MR1（TCR信号）和B18R（中和I型干扰素）对MAIT细胞反应的抑制效果更强，表明在MAIT细胞对大肠杆菌的早期反应中，TCR信号和I型干扰素是关键信号，而IL-21的作用相对次要。对RNA测序数据的分析显示，外周血单个核细胞中的MAIT细胞仅表达微量的IL21，但大肠杆菌刺激后其表达有所增加。流式细胞术检测也发现，大肠杆菌刺激6小时后，仅有少量CD4+T细胞和MAIT细胞产生IL-21。
3.6 IL-21增强MAIT细胞的直接杀伤能力
研究使用了一种基于流式细胞术的细胞毒性试验，评估了经IL-21预处理的MAIT细胞对5-OP-RU处理的B细胞淋巴母细胞系的杀伤能力。结果显示，与外周血单个核细胞对照组相比，用IL-21预处理24小时能显著增强MAIT细胞对5-OP-RU处理靶细胞的杀伤。这种杀伤是TCR依赖性的，因为抗MR1抗体可以完全阻断杀伤作用，且IL-21预处理不能使MAIT细胞杀伤未经处理的靶细胞。使用Vα7.2+细胞作为效应细胞也观察到了类似的、小幅但显著的杀伤增强。
4 讨论
本研究证明了IL-21能增强激活的MAIT细胞的细胞毒性潜能。在体外实验中，IL-21显著增强了TCR和细胞因子激活的MAIT细胞的GrzB和穿孔素表达，并提高了其杀伤5-OP-RU处理靶细胞的能力。值得注意的是，虽然IL-21上调了细胞毒性分子的表达，但对IFN-γ、TNF-α或IL-17A的表达影响甚微，这表明它在启动MAIT细胞发挥细胞毒性功能方面具有特异性作用。
MAIT细胞细胞毒性分子的表达是一个时间依赖性的过程。在TCR依赖的早期激活阶段（6小时），IL-21增强了GrzB的表达，而穿孔素的表达则被IL-21独立于TCR刺激而上调。在更长时间的刺激下，IL-21也能影响其他细胞毒性分子如GrzA和颗粒溶素的表达。
研究还发现，用IL-21预处理MAIT细胞24小时，能小幅但显著地增强其TCR依赖性杀伤能力。这与之前关于其他细胞因子（如IL-7）或细菌预处理的报道类似，表明额外的信号可以增强MAIT细胞的杀伤能力。
在机制上，IL-21和5-OP-RU联合处理显著增强了MAIT细胞中Blimp-1的表达，并强烈诱导了STAT蛋白（尤其是STAT3）的磷酸化。STAT3信号的增强可能与IL-21驱动的MAIT细胞GrzB表达上调和细胞因子（如IL-2、TNF-α）产生减少有关。
然而，研究也注意到了一些不一致之处。例如，在分选的Vα7.2+细胞中，IL-21引起的GrzB上调不如在外周血单个核细胞培养中明显，并且未观察到穿孔素的上调。这提示IL-21的作用可能部分是间接的，受到外周血单个核细胞中其他细胞的影响。此外，尽管RNA测序显示IL21R基因表达上调，但在蛋白水平未能明确检测到MAIT细胞表面的IL-21R，这可能与受体表达水平低有关。
研究还探讨了IL-21在MAIT细胞对细菌反应中的作用。阻断IL-21R会降低大肠杆菌刺激的MAIT细胞的GrzB表达，但效果弱于阻断TCR或I型干扰素信号。这表明在MAIT细胞对细菌的早期反应中，IL-21并非主导信号，但仍参与其中。虽然检测到的IL-21产生量很少，但可能少量IL-21就足以调节MAIT细胞功能。
总之，本研究揭示了一个先前未被探索的IL-21功能：它选择性地增强抗原激活的MAIT细胞的细胞毒性潜能，而不显著影响其早期的细胞因子产生。这一发现对于理解MAIT细胞功能的调控机制，以及开发针对MAIT细胞的免疫疗法具有重要意义。未来的研究需要进一步厘清IL-21对MAIT细胞作用是直接还是间接的，并探究其在组织驻留MAIT细胞和体内环境中的作用。
