《Materials Today Bio》：Application of a Novel Myristoylproteomics Approach Identifies GLIPR2 as a Key Pro-Ferroptotic Substrate in Non-Small Cell Lung Cancer
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肿瘤细胞对铁死亡的敏感性受蛋白翻译后修饰调控，但N-豆蔻酰化（myristoylation）在此过程中的作用尚不明确。本文中，研究人员运用创新的豆蔻酰化蛋白质组学技术，在非小细胞肺癌细胞中筛选鉴定出GLIPR2为关键促铁死亡底物。研究发现，其N端豆蔻酰化修饰对于定位于内质网并发挥功能至关重要，从而揭示了NMT1/NMT2-GLIPR2这一全新的调控轴，为克服铁死亡抵抗提供了新的理论基础与治疗策略。
在癌症治疗研究中，一种名为“铁死亡”的程序性细胞死亡方式近年来备受关注。它的发生依赖于铁离子催化的脂质过氧化反应，核心机制与谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的功能缺失或谷胱甘肽（GSH）耗竭紧密相关。然而，肿瘤细胞对铁死亡的敏感性千差万别，这背后复杂的调控网络，尤其是蛋白质翻译后修饰如何“微调”这一过程，仍是一个巨大的“黑箱”。在众多修饰中，蛋白质的N-豆蔻酰化修饰，即在蛋白质N端添加一个十四碳的豆蔻酰基团，是调控蛋白质膜定位与稳定性的关键一环。已知某些蛋白如铁死亡抑制蛋白1（FSP1）的豆蔻酰化能抑制铁死亡。但一个关键问题悬而未决：这种修饰是否也存在“双重人格”，能够促进铁死亡？其核心催化酶N-豆蔻酰转移酶（NMT1和NMT2）的活性与肿瘤细胞的铁死亡敏感性有何关联？是否有新的、促进铁死亡的豆蔻酰化蛋白等待被发现？解答这些问题不仅有望填补铁死亡调控网络的空白，更可能为对抗肿瘤的铁死亡抵抗提供全新的治疗靶点。然而，技术上的瓶颈严重阻碍了探索进程：传统的豆蔻酰化检测方法，如使用炔基化豆蔻酸类似物进行代谢标记，往往存在覆盖率低、无法精确定位修饰位点、在脂质代谢旺盛的细胞中标记效率不佳等问题，限制了在生理相关模型（如组织样本）中的应用和对新调控蛋白的发现。发表于《Materials Today Bio》的这项研究，正是为了突破这些局限。研究人员建立了一套优化的基于点击化学的豆蔻酰化蛋白质组学工作流程，并以非小细胞肺癌为模型，系统地探索了NMT1/NMT2介导的豆蔻酰化在铁死亡中的作用及其分子机制。
为开展这项研究，作者团队应用了几个关键技术方法：首先是优化的豆蔻酰化蛋白质组学工作流程，通过代谢标记（YnMyr）、点击化学（CuAAC）耦联和富集（使用可断裂的AzDADPSB试剂），实现了对豆蔻酰化蛋白及其修饰位点的大规模、高灵敏度鉴定。其次，运用了基因编辑（CRISPR-Cas9）和药物抑制（IMP-1088）手段，分别在细胞系中敲除NMT1、NMT2、GLIPR2基因或抑制其酶活性，以验证它们在铁死亡中的功能。此外，研究还结合了功能筛选（siRNA干扰）、体外细胞活力/死亡/脂质过氧化检测、以及体内肿瘤模型验证，包括Calu-1细胞来源的异种移植（CDX）模型和来自上海胸科医院肺癌患者组织的患者来源异种移植（PDX）模型。最后，利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对铁死亡相关脂质代谢物进行了靶向分析。
研究结果
NMT1/NMT2表达与铁死亡敏感性正相关
通过对癌症治疗反应门户数据库的分析，研究人员发现，在超过800个癌细胞系中，NMT1和NMT2的高表达与对铁死亡诱导剂（erastin， RSL3， ML162）的敏感性增加（即耐药性降低）呈正相关。在非小细胞肺癌细胞模型（铁死亡敏感的Calu-1细胞和耐受的H460细胞）中进一步验证了这一点，敏感细胞中NMT1和NMT2的蛋白水平显著更高。
NMT1/NMT2缺失减弱铁死亡敏感性
在敏感的Calu-1细胞中，通过CRISPR-Cas9技术分别敲除NMT1或NMT2，均能显著降低细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。同时敲除两者（双敲除）比单敲除效果更明显。使用豆蔻酰化抑制剂IMP-1088处理细胞，也观察到了类似的铁死亡抵抗表型。
过表达NMT1/NMT2增强铁死亡敏感性
在铁死亡耐受的H460细胞中过表达NMT1或NMT2，能够增强这些细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。这些结果共同表明，NMT1和NMT2是铁死亡的正向调控因子。
建立并优化基于点击化学的豆蔻酰化检测工作流程
研究团队建立了一套优化的豆蔻酰化检测流程：用炔基化豆蔻酸类似物YnMyr代谢标记细胞，通过铜催化的叠氮-炔环加成反应将标记蛋白与捕获试剂（如TAMRA生物素叠氮，AzTB）连接，从而进行检测和富集。更重要的是，他们比较了两种捕获试剂（AzRB和AzDADPSB），发现后者能通过酶解后特异性酸洗脱豆蔻酰化肽段，显著提高了修饰位点的鉴定数量，因此被选用于后续的豆蔻酰组学分析。他们还观察到，在铁死亡敏感的Calu-1细胞中，用erastin或RSL3刺激会提高全局蛋白豆蔻酰化水平。
豆蔻酰组学分析鉴定与铁死亡相关的候选蛋白
应用优化的AzDADPSB工作流程，研究人员对Calu-1和H460细胞进行了定量的豆蔻酰组学分析，重点筛选在敏感细胞中豆蔻酰化水平更高的蛋白。通过结合数据库相关性分析，他们最终将候选范围缩小到五个蛋白：OCC1、RFTN1、GLIPR2、OGFRL1和FYN。
功能筛选验证GLIPR2等关键豆蔻酰化蛋白调控铁死亡
通过小干扰RNA敲低候选基因，发现敲低GLIPR2、RFTN1和OCC1会显著降低Calu-1细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。进一步的数据库分析显示，高表达GLIPR2与对铁死亡诱导剂的敏感性相关性最强。Western Blot实验证实，GLIPR2和RFTN1的豆蔻酰化能被IMP-1088抑制，且在敏感细胞中其基础豆蔻酰化水平更高。
GLIPR2通过豆蔻酰化依赖的内质网定位促进铁死亡
研究证实，敲除GLIPR2会削弱铁死亡敏感性，而重新导入野生型GLIPR2可以恢复敏感性。然而，导入一个豆蔻酰化缺陷突变体（第2位甘氨酸突变为丙氨酸，G2A）则无法恢复。质谱直接鉴定到了GLIPR2 N端的YnMyr修饰肽段。免疫荧光显示，野生型GLIPR2定位于内质网（ER），而G2A突变或IMP-1088处理会破坏这种定位。进一步构建并测试了一系列靶向不同细胞器的GLIPR2（G2A）融合蛋白，发现只有强制定位于内质网的融合蛋白（GLIPR2(G2A)-Cb5）能够像野生型一样恢复促铁死亡功能，而靶向高尔基体、质膜或线粒体的突变体则不能。这证明GLIPR2的促铁死亡功能严格依赖于其豆蔻酰化修饰所介导的内质网定位。
GLIPR2通过上调LPCAT3驱动脂质过氧化诱导铁死亡
机制探索发现，GLIPR2敲除会特异性下调溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（LPCAT3）的表达，并抑制铁死亡诱导过程中产生的促铁死亡脂质过氧化产物PE-AA-OOH和PE-AdA-OOH的生成及其前体PE-AA和PE-AdA的消耗。然而，铁死亡过程中铁离子（Fe2+）的积累和谷胱甘肽（GSH）的耗竭不受GLIPR2状态的影响。这表明GLIPR2通过上调LPCAT3来驱动脂质过氧化，从而特异性促进铁死亡。
NMT1/2通过GLIPR2豆蔻酰化在体内增强铁死亡敏感性
体内实验进一步验证了该调控轴。在Calu-1异种移植瘤模型中，过表达NMT1/2能增强铁死亡诱导剂IKE对肿瘤生长的抑制效果，并伴随肿瘤组织脂质过氧化（MDA）水平升高。然而，当同时敲除GLIPR2时，NMT1/2过表达带来的促铁死亡优势几乎完全消失。此外，在来源于临床肺癌组织的患者来源异种移植模型中发现，高表达NMT1/2的肿瘤对IKE处理更敏感，表现出更显著的细胞死亡和脂质活性氧生成。这些结果共同证明，NMT1/2通过促进GLIPR2的豆蔻酰化来增强肺癌细胞的铁死亡敏感性。
研究结论与意义
这项研究首次系统阐明了NMT1和NMT2通过介导关键效应蛋白的豆蔻酰化来增强非小细胞肺癌细胞铁死亡敏感性的新机制。其核心贡献在于，借助团队自主研发并优化的点击化学豆蔻酰化蛋白质组学工作流程，成功克服了该领域长期存在的技术瓶颈，从而鉴定并验证了GLIPR2这一全新的促铁死亡豆蔻酰化底物。研究发现，GLIPR2的促铁死亡功能严格依赖于其N端的豆蔻酰化修饰，该修饰引导其定位于内质网，并通过上调内质网驻留酶LPCAT3来驱动脂质过氧化，最终导致细胞死亡。
这项工作的意义是多方面的。在理论层面，它打破了以往主要关注豆蔻酰化在抑制铁死亡（如FSP1）中的作用的认知，揭示了该修饰同样具有促铁死亡的“另一面”，极大地拓展了铁死亡调控网络的分子图谱，明确了“NMT1/NMT2–豆蔻酰化–GLIPR2”这一全新的调控轴。在技术层面，所建立的豆蔻酰化蛋白质组学工作流程具有高灵敏度、高特异性和可应用于组织样本等优势，为未来在癌症及其他疾病中深入研究豆蔻酰化功能提供了强大的工具。在转化医学层面，该研究为克服肿瘤（尤其是非小细胞肺癌）的铁死亡抵抗提供了新的潜在靶点。NMT1/NMT2或GLIPR2的表达水平有望成为预测患者对铁死亡诱导疗法敏感性的生物标志物，而针对NMT-GLIPR2轴的干预策略（如联合使用铁死亡诱导剂和靶向该通路的小分子）则可能发展成为一种新的治疗组合。当然，研究也指出了未来的方向，例如需进一步阐明GLIPR2与LPCAT3之间的精确分子联系，并系统探索NMT是否还通过其他底物调控铁死亡。总体而言，这项研究不仅深化了对铁死亡机制的理解，也为开发基于蛋白豆蔻酰化调控的精准抗癌疗法奠定了重要的理论和实践基础。
