氧化低密度脂蛋白诱导人CD4+T细胞促炎性转录组与表观组反应中文标题

《The FASEB Journal》：Oxidized LDL Induces Pro-Inflammatory Transcriptomic and Epigenomic Responses in Human CD4+ T Cells

本研究揭示了动脉粥样硬化关键风险因子——氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对人活化CD4+T细胞的深度调控机制。文章通过整合多组学分析，发现ox-LDL驱动T细胞向促炎、细胞因子高产的转录组状态转变，并伴随全基因组范围的染色质可及性变化，特别是启动子区域。研究鉴定出NRF1和SP1转录因子是介导这些变化的关键调控者，同时发现AP-1相关因子的调控作用减弱。更值得注意的是，研究发现多个冠状动脉疾病(CAD)相关的单核苷酸多态性(SNP)位点位于ox-LDL调控的动态染色质区域内（如rs936395和rs1332328），为理解CAD遗传风险如何在特定细胞类型中与环境风险因子（如高LDL-C）相互作用提供了新的分子机制见解。这项工作深化了对CD4+T细胞在动脉粥样硬化中作用的理解，并为开发针对特定细胞类型的CAD靶向疗法指明了方向。

　　

1 引言

缺血性心脏病是全球主要的死亡原因，通常由冠状动脉疾病(CAD)引起。CAD源于动脉粥样硬化，这是一种导致斑块形成的慢性炎症过程。动脉粥样硬化受遗传和环境风险因素的影响，两者可能相互作用，例如通过影响循环低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇水平，这是一个关键的疾病风险相关因素。当LDL被氧化形成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)时，其致病性尤为显著。ox-LDL可与免疫细胞相互作用并被其内吞，扰乱其功能。

CD4⁺T细胞是动脉粥样硬化病变中最丰富的免疫细胞类型之一，在单细胞RNA测序研究中占斑块内免疫细胞的30%以上。这些斑块中的CD4⁺T细胞 predominantly 处于活化状态，并以不同亚群存在，对动脉粥样硬化发生具有不同的功能相关性。例如，在小鼠模型中，活化的T_H1和T_H17细胞在动脉粥样硬化背景下促进炎症，而T_reg细胞被认为是动脉粥样硬化保护性的。CD4⁺T细胞的分化和功能受基因表达调控，而基因表达又深受影响染色质可及性的表观基因组修饰的影响。这些染色质变化可以影响转录因子(TF)的结合和基因表达。

本研究旨在表征ox-LDL暴露如何调控活化的原代人CD4⁺T细胞，因为活化的CD4⁺T细胞在动脉粥样硬化斑块内会暴露于ox-LDL。我们揭示了ox-LDL处理引发促炎细胞因子反应，其中存在核呼吸因子1(NRF1)和特异性蛋白1(SP1)转录因子结合基序的表观基因组变化。我们发现多个CAD相关的单核苷酸多态性(SNP)位于ox-LDL调控的基因组区域。我们为rs936395位点促进SP1结合以及rs1332328位点影响淋巴脂肪酶A，溶酶体酸性类型(LIPA)表达提出了可能的因果机制。

2 方法

研究获得了NHS研究伦理委员会的伦理批准，所有参与者均提供了知情同意。从健康志愿者采集外周血，通过密度离心分离外周血单个核细胞(PBMCs)。使用CD14微珠孵育PBMCs以分离和去除血单核细胞群。未结合的细胞在用珠结合的anti-CD3和anti-CD28于37°C激活前，用CD4微珠孵育。ox-LDL由新鲜人血制备。

激活后，细胞用50 μg/mL ox-LDL或等体积的对照缓冲液处理48小时。对于RNA测序，使用TRIzol和PureLink RNA mini kit提取RNA。进行Illumina反向链TruSeq文库制备后进行测序。对于染色质免疫沉淀(ChIP)-测序，使用MAGnify染色质免疫沉淀系统，使用2 μL抗体。使用Qiagen MinElute试剂盒纯化DNA后进行TruSeq接头连接。对于ATAC测序，样品反复离心，然后将核沉淀悬浮在含有2.5 μL Illumina DNA样品制备试剂盒中的高活性Tn5转座酶和22.5 μL无核酸酶水的转座反应混合物中，并在37°C孵育30分钟。转座的DNA用Qiagen MinElute试剂盒纯化并通过PCR扩增。RNA、ATAC和ChIP文库在Illumina Hi-Seq 2500和Hi-Seq 4000测序平台上进行50碱基对(bp)或75 bp测序。

原始读取使用STAR比对到人类基因组GRCh38，并使用Rsubread中的FeatureCounts包生成重叠基因的读取计数矩阵。使用edgeR进行下游差异基因表达分析。使用clusterprofiler进行基因本体(GO)生物过程术语的基因集富集分析。使用Cytoscape从STRING数据库生成蛋白质-蛋白质相互作用网络。

使用NGmerge修剪ATAC测序读数的接头内容，然后使用bowtie2将ChIP和ATAC读数比对到GRCh38基因组。从ChIP和ATAC实验中过滤重复读数，并从ATAC测序比对中过滤比对到线粒体基因组的读数。ATAC-seq比对移动+4/?5 bp以代表Tn5转座的中心。使用deepTools生成两种测序模式的每百万计数归一化覆盖轨道，并使用IGV基因组浏览器可视化。使用MACS3为ChIP和ATAC测序生成共识峰集。与共识ATAC峰区域+/-250 bp重叠的H3K27ac峰被视为重叠。使用ChIPseeker注释ATAC峰，将与转录起始位点(TSS)周围-1000到+200 bp区域重叠的峰定义为“启动子”。使用FeatureCounts、csaw和edgeR进行ATAC测序的差异可及性分析。使用HOMER和TOBIAS对ox-LDL上调和下调的峰进行基序富集分析和TF足迹分析。

使用LISA2预测具有输入共识峰集和差异表达基因列表的转录调节因子。该软件识别一系列假定的转录调节因子，并推导其影响基因表达的p值。通过结合LISA、TOBIAS和HOMER预测的转录调节因子，生成一个被认为影响ox-LDL调控基因表达的转录因子共识集。

从NHGRI-EBI Catalog下载单核苷酸多态性(SNP)、伴随性状和p值。仅选择与搜索词“冠状动脉疾病”相关且具有显著全基因组关联(p < 5e-8)的SNP进行进一步分析。这些在Plink中进行聚类以识别独立风险位点；最终变异集通过建立与那些独立风险位点处于连锁不平衡(LD)的SNP来计算。本研究使用常见SNP变异。然后使用IRanges中的FindOverlaps函数识别与ox-LDL调控的可及染色质区域重叠的SNP。我们优先从GTEx v8和eQTLGen数据库获得的eQTL SNP进行进一步研究。为了识别被这些SNP破坏的基序，使用R包motifbreakR和随附的hocomoco基序包。选择性地识别中断感兴趣TF基序的SNP，并使用motifbreakR中的plotMB函数绘制相关SNP。然后使用深度学习AlphaGenome模型对这些优先SNP进行变异效应预测和评分。

从序列读取档案下载na?ve和活化的人CD4⁺T细胞Hi-C数据。使用HiCUP管道将原始文件比对到GRCh38基因组。使用bowtie2比对器。使用默认的最大和最小双标签长度。在HiCUP输出目录上运行hicup2homer脚本后，使用HOMER进行比对数据的下游分析。使用HOMER findHiCInteractionsByChr.pl搜索显著的染色体内相互作用。然后合并样本相互作用文件，并通过选择具有最高logP值的相互作用来过滤重复相互作用。然后从注释文件中分离TSS，并使用HOMER annotateInteractions.pl定义启动子区域与具有ATAC-和H3K27ac-ChIP-seq信号的区域之间的显著物理相互作用，将这些区域称为“假定增强子”。使用clusterprofiler对与ox-LDL上调的“假定增强子”接触的基因进行基因本体富集分析。

3 结果

3.1 Ox-LDL在CD4⁺T细胞中引发炎症转录组反应

由于人动脉粥样硬化斑块中的大多数CD4⁺T细胞是活化的，从新鲜人血中分离原代人CD4⁺T细胞并用CD3/CD28共刺激激活。然后将它们暴露于ox-LDL或缓冲液，并使用RNA测序进行分析。主成分分析(PCA)表明，所有样品之间的主要方差来源可归因于细胞暴露于ox-LDL。相比之下，PC2的分布与个体之间预期的生物变异一致。差异基因表达(DGE)分析共鉴定出5211个差异表达基因。使用之前对动脉粥样硬化斑块单细胞RNA测序数据集的荟萃分析，发现活化斑块CD4⁺T细胞的全转录组表达与我们的离体CD4⁺T细胞之间有良好的相关性。与暴露于缓冲液的细胞相比，暴露于ox-LDL使853个基因的表达增加超过2倍，并使1221个基因的表达降低超过2倍。上调的基因包括与炎症活性相关的基因，如TNF、IFNG、FASLG和IL6，以及参与代谢的基因，如ACOX1。这些上调的细胞因子也已被证明在单核细胞和外周血单个核细胞中被ox-LDL上调。然而，CD4⁺T细胞激活诱导的基因表达变化效应大小与ox-LDL暴露诱导的变化之间没有相关性。基因集富集分析鉴定了在暴露于ox-LDL的CD4⁺T细胞中上调和下调的GO生物过程术语。这些包括与细胞激活、迁移和细胞适应较低氧水平相关的变化。为了识别被ox-LDL上调的相互作用蛋白质，使用String蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)数据库构建蛋白质网络。这揭示了一个包含多种促炎细胞因子的大型网络。

1 (red) or < 1 (blue) in cells exposed to ox-LDL compared to cells exposed to buffer. (C) Plot of read counts per million expressions for selected genes. p values were computed using the quasi-likelihood F-test, and error bars indicate the mean ± SEM. (D) Gene set enrichment analysis of GO biological process terms for cells exposed to ox-LDL compared to cells exposed to buffer. (E) PPI network constructed from the String database, subclustered with granularity 2.5. Nodes are colored by log2 (fold change).">

3.2 Ox-LDL引起开放染色质分布的显著变化，增加SP1和NRF1基序的可及性

鉴于ox-LDL暴露引发的基因表达发生实质性变化，我们使用ATAC-seq来表征影响这些转录组变化的调控元件。与RNA-seq数据一样，ATAC-seq数据的PCA表明，样品之间的大部分变异可归因于暴露于ox-LDL，其余变异与个体之间预期的生物变异一致。为了识别ox-LDL诱导的可及性发生变化的基因组区域，我们在共识开放染色质峰处进行了差异可及性分析。在鉴定出的23453个差异可及峰中，15166个在ox-LDL暴露后更易接近，并且主要位于基因的启动子区域。相比之下，在ox-LDL暴露后可及性降低的基因组区域更常位于下游或远端基因间位置。我们分析了这些被ox-LDL改变的染色质区域内不同TF基序的频率，相对于未受ox-LDL影响的染色质区域内的频率。值得注意的是，NRF1和SP1基序在ox-LDL上调的峰中富集。此外，TF足迹分析揭示了ATAC-seq峰中信号较低的局部区域，表明TF结合，这些区域与已知的TF基序重叠。其中包括ETS结构域TFs ELK1和ELK4，它们之前已被证明在CD8⁺T细胞分化中起作用。相比之下，AP-1(FOS/JUN)相关基序在ox-LDL暴露后染色质可及性降低的基因组区域中富集，TF足迹分析与CD4⁺T细胞暴露于ox-LDL后结合到这些基序的TFs存在减少一致。

1 (red) or < 1 (blue) in ox-LDL compared to buffer-treated CD4+ T cells. Pie charts of ChIPseeker annotations for chromatin regions determined to be more (C) or less (D) accessible following exposure of cells to ox-LDL. (E) and (G) HOMER motif enrichment analysis for chromatin regions that have up- (E) or down- (G) regulated accessibility induced by exposure of cells to ox-LDL. Motifs are shown next to their log10 (p value for motif enrichment over background). (F) Volcano plot of TF footprinting. Dots represent different TFs, and TFs are indicated with colored dots when they were determined as significant by a -log10 (p-value) above the 95% quantile and/or differential binding scores smaller than the 5% (blue) or larger than the 95% (red) quantiles. TFs are labeled where the TF was determined as a putative regulator by footprinting, motif enrichment, and landscape in silico deletion analysis.">

3.3 NRF1和SP1部分调控Ox-LDL诱导的转录组变化

为了评估ox-LDL诱导的染色质可及性变化是否与相应的基因表达变化相关，我们试图整合RNA和ATAC测序数据。我们应用表观遗传景观计算机删除分析(LISA)来识别可能影响基因表达的假定TFs。LISA计算了表达的TF是否优先影响某个基因的表达相对于随机抽样的背景基因的p值和调控分数，从而预测动态调控的TFs。其中，NRF1和SP1调控元件对于影响ox-LDL上调的基因达到统计学显著性。相比之下，AP-1元件与响应ox-LDL暴露的一组基因的下调有关。LISA热图分析与NRF1对ACOX1表达的影响一致，ACOX1在脂肪酸代谢中很重要。整合来自HOMER基序分析、LISA多组学整合和TF足迹分析的发现，使我们能够识别一个被所有三种方法预测为调控ox-LDL诱导或抑制基因表达程序的TF共识集。我们通过对编码TF的基因是否以> 1 logCPM的水平表达来对这些共识TFs进行进一步测试。在我们的17个共识TF中，只有KLF1和MEIS1在我们的人CD4⁺T细胞RNA-seq数据集中没有表达。有趣的是，我们观察到响应ox-LDL，FOS和JUN显著下调，这与AP-1相关TFs在ox-LDL暴露后发挥较少调控影响的预测一致。

3.4 Ox-LDL在假定增强子区域调控染色质可及性

除了ATAC和RNA测序，我们还对暴露于ox-LDL或缓冲液的CD4⁺T细胞进行了H3K27ac-ChIP测序，以支持可及染色质区域的注释。大多数H3K27ac峰与开放染色质区域重叠，主要是在启动子区域。然而，我们还鉴定了10224个非启动子开放染色质峰，这些峰存在H3K27ac信号。使用公开可用的CD4⁺T细胞Hi-C数据，我们鉴定了与启动子区域具有显著染色体内接触的H3K27ac峰，这与物理的启动子-增强子相互作用一致。我们将这些区域称为“假定增强子”，并详细说明了其启动子区域与每个“假定增强子”接触的基因。从假定增强子区域到其启动子接触的平均距离为247 kb。在这些假定增强子中，有2126个位于ox-LDL改变染色质可及性的基因组位点，这与ox-LDL对基因调控的影响部分通过动态增强子元件介导一致。其中1138个增强子的log₂染色质可及性变化倍数大于1，这些增强子靶向的基因集富集了参与T细胞分化的基因。染色质构象捕获数据显示，多个在ox-LDL暴露后可及性增加的假定增强子与我们的一个促炎差异表达基因TNF的启动子区域接触。

3.5 CAD特异性SNP与Ox-LDL调控基因组位点之间的重叠

为了评估这些表观基因组变化的临床相关性，我们检查了疾病相关SNP与ox-LDL暴露改变可及性的染色质区域之间的重叠。我们鉴定了202个位于ox-LDL暴露上调或下调染色质可及性的基因组区域的CAD SNP，其中102个在GTEx v8或eQTLGen全血数据库中被鉴定为eQTL。值得注意的是，这些CAD相关的eQTL SNP中有17个发生在与ox-LDL诱导和抑制基因调控有关的TF基序中。选择rs936395和rs1332328 SNP进行进一步研究，因为这些位点染色质可及性变化的幅度以及它们对脂质生物学的预测相关性。rs936395位点的替代“C”等位基因增加了SP1对该位置SP1基序的预测结合亲和力。对ATAC测序读数的更仔细检查表明，细胞暴露于ox-LDL与该位点染色质可及性的显著增加相关。有趣的是，AlphaGenome模型还预测，替代rs936395等位基因可能会损害该区域CCCTC结合因子(CTCF)的结合，这或许有助于增加SP1结合。另外，我们发现优先的rs936395 SNP是全血中LIPA的eQTL SNP，LIPA是一种脂质代谢酶。然后，我们使用深度学习AlphaGenome变异效应评分来预测我们优先的变异在CD4⁺T细胞中的特异性影响。与全血eQTL数据一致，该分析还预测替代rs1332328 'T'等位基因降低了人CD4⁺T细胞中LIPA的表达。

4 讨论

CAD是一种复杂的疾病，涉及多种细胞类型和途径之间数十年的相互作用。为了剖析这种复杂性，我们重点关注了人外周血来源的CD4⁺T细胞对ox-LDL的反应，正如我们之前对巨噬细胞和内皮细胞所做的那样。了解特定细胞类型对ox-LDL的具体反应有可能为病理生理学和治疗靶点提供重要见解。我们证明ox-LDL触发活化的原代人CD4⁺T细胞中基因表达和染色质可及性的实质性变化。这些变化包括一系列促炎基因的表达增加，包括多种细胞因子，并且与ox-LDL在诱导T_H1细胞亚型中的已知作用一致。在活化的CD4⁺T细胞中响应ox-LDL上调的细胞因子包括IL6、IFNG和TNF。这些细胞因子已被证明在其他PBMC来源的细胞中被ox-LDL上调，并有助于CAD的病理生理学。最近一项细胞转录组和表位索引(CITE)-测序数据的研究也揭示了斑块CD4⁺T细胞中这些细胞因子通路的表达上调，相对于外周血CD4⁺T细胞。这些发现表明，未来有必要对ox-LDL与CD4⁺T细胞细胞因子产生和释放之间的相互作用进行机制研究。ox-LDL在CD4⁺T细胞中触发这些效应的机制尚不清楚。据报道，ox-LDL通过LOX-1受体和CD69在T淋巴细胞中发挥作用。先前的一项T细胞转录组研究发现，ox-LDL暴露上调了抗炎TFs NR4A1和NR4A3的表达；然而，我们在本研究中没有观察到这些TFs的上调。

我们和其他人已经表明，ox-LDL在巨噬细胞和内皮细胞及其祖细胞中诱导染色质可及性的广泛变化。然而，ox-LDL在人CD4⁺T细胞中触发的表观基因组变化以前尚未被研究。我们证明了ox-LDL诱导的实质性变化，特别是在启动子区域可及性显著增加。这些以启动子为主的变化在已被CD3/CD28共刺激激活的CD4⁺T细胞中如何介导其全面调节作用的机制仍有待未来研究探索。介导这些变化的机制可能涉及活性氧(ROS)或通过ERK1/2信号直接激活组蛋白去乙酰化酶。

我们已经鉴定了基因组中ox-LDL暴露改变活化CD4⁺T细胞染色质可及性的位点；DNA足迹和基序分析鉴定了可能结合这些位点的TFs。值得注意的是，NRF1和SP1基序在ox-LDL调控的染色质区域中富集。计算机删除分析还基于我们的多组学数据以及之前的ChIP-seq研究数据库，独立推断出NRF1和SP1的调控作用。NRF1与NRF2协同作用，激活多种代谢基因的表达，包括参与肝脏胆固醇清除的基因。ox-LDL先前已被报道在巨噬细胞中诱导NRF1与其基序的结合。同样，SP1已被证明在平滑肌和系膜细胞中被ox-LDL激活。这些TFs可能协同响应ox-LDL以刺激细胞因子表达，未来的研究可以通过包括基因操纵这些TFs表达在内的方法进行实验探索。

相比之下，激活蛋白1(AP-1)基序活性降低，表明在活化的CD4⁺T细胞中暴露于ox-LDL后，AP-1 TFs的影响减少。AP-1 TFs通常是FOS和JUN蛋白的异源二聚体，调节多种基因的表达。FOS基因表达被ox-LDL下调，但TF也可以在不改变TF本身表达的情况下改变基因的表达。有趣的是，这与其他细胞类型中的发现形成对比。单细胞RNA测序和免疫组织化学均已显示动脉粥样硬化病变的血管细胞和单核细胞中活化的AP-1上调。然而，也有来自巨噬细胞的证据表明，响应ox-LDL，AP-1在特定启动子处的结合下调。我们最近还证明了ox-LDL在原代巨噬细胞和内皮细胞中激活AP-1位点。尽管AP-1通常调节T细胞激活和细胞因子产生，但它似乎对我们观察到的CD4⁺T细胞中的促炎细胞因子表达没有净贡献。这表明ox-LDL可以调节预激活的CD4⁺T细胞中的AP-1反应，并且TFs以细胞和基因组区域特异性的方式受到ox-LDL的影响。

CAD的很大一部分遗传力归因于赋予CAD易感性增加的SNP。我们发现许多CAD相关的SNP位于ox-LDL改变DNA可及性的基因组区域。为了优先处理这些SNP，我们选择了那些是ox-LDL上调基因的eQTL SNP的SNP。通过专注于改变预测影响CD4⁺T细胞对ox-LDL反应的TF基序的SNP，进一步完善了该列表。该分析优先考虑了rs936395，位于WBP2基因的内含子或启动子区域，以及rs1332328，靠近LIPA基因的TSS。值得注意的是，rs936395 SNP的替代等位基因被预测会减少CTCF的结合，而CTCF对基因组组织很重要，同时增加了SP1的预测结合。有趣的是，rs936395和rs1332328之前均未被鉴定为主要变异，而是分别与CAD相关的rs78532451和rs1412444处于高LD。WBP2基因的作用仍然知之甚少，尽管最近的证据表明WBP2可能充当癌基因。然而，在我们的RNA测序数据集中，我们注意到WBP2在我们的CD4⁺T细胞中被oxLDL上调，这表明WBP2的功能可能会受到常见代谢风险因素的影响。相比之下，LIPA与CAD的关联已有充分记载。然而，LIPA变体的大部分功能表征是在髓系细胞中进行的。我们发现rs1332328 SNP位于oxLDL增加CD4⁺T细胞染色质可及性的基因组区域，这表明LIPA也通过淋巴样细胞中未定义的途径促进CAD。然而，用于变异效应预测的深度学习模型仍处于起步阶段，AlphaGenome做出的预测值得进一步的实验验证。未来的功能研究，如基于CRISPR的基因组编辑或荧光素酶报告基因检测，可用于研究CD4⁺T细胞中这些非编码变异的潜在因果机制。

总之，我们在转录组和表观基因组水平上表征了先前未定义的CD4⁺T细胞对ox-LDL的反应。我们假设这种促炎反应受NRF1和SP1 TFs调控并促进动脉粥样硬化发生。我们将CAD相关的SNP鉴定为在CD4⁺T细胞中研究的优先SNP，并为rs936395和rs1332328位点提出了假定的因果机制。我们的工作说明了理解细胞类型特异性对促动脉粥样硬化风险因子反应的重要性。