《Microbiological Research》：Involvement of Two ESCRT-Ⅲ Accessory Proteins, MoDid2 and MoVta1, in Development, Pathogenicity, and Endocytosis in
Magnaporthe oryzae
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稻瘟病菌ESCRT-Ⅲ辅助蛋白Did2和Vta1的功能研究表明其参与营养生长、分生孢子形成、致病性及非生物胁迫响应，通过调控Oms1和Pmk1 MAPK通路影响内吞作用及K63泛素化水平，其中MoDid2还参与自噬过程，为稻瘟病防治提供新靶点。
Jian Liao|Zi-Fang Shen|Jing-Yi Wang|Meng-Fan He|Hong-Min Lv|Jin Zhao|Wen-Hui Zhao|Lin Li|Zi-He Wang|Li-Xiao Sun|Irshad Ali Khan|Xue-Ming Zhu|Jian-Ping Lu|Fu-Cheng Lin|Xiao-Hong Liu
中国浙江省杭州市浙江大学生物技术研究所水稻生物学与育种国家重点实验室，邮编310058
摘要
内体分选复合体（ESCRT）是真核生物中负责膜重塑的高度保守的系统。ESCRT-Ⅲ辅助蛋白的生物学功能，尤其是在Magnaporthe oryzae中的功能，目前仍知之甚少，尤其是在与货物分选的最终步骤相关方面。在这项研究中，我们鉴定了M. oryzae中的Did2和Vta1蛋白，并阐明了它们的生物学功能。我们的发现表明，MoDid2和MoVta1主要定位于内体中，在营养生长、分生孢子形成和致病性中发挥重要作用。此外，MoDid2和MoVta1还参与非生物胁迫反应，并通过参与Oms1 MAPK和Pmk1 MAPK通路以及调节K63连接的泛素化水平来影响内吞作用。另外，MoDid2影响自噬作用，而MoVta1则不受影响。总之，我们的发现揭示了Did2/Vta1与M. oryzae致病性之间的关联，为控制稻瘟病提供了新的见解。
引言
内体分选复合体（ESCRT）是真核生物中一种保守的膜重塑机制，由四个复合体（ESCRT-0、-I、-II和-III）以及几个辅助成分组成（Raiborg和Stenmark，2009）。研究表明，ESCRT在真核细胞中具有多种保守的功能，其中最经典的功能是内体分选和内腔囊泡（ILVs）的生成。在内吞作用过程中，ESCRT识别泛素化的蛋白质并将它们分选到多囊泡体（MVBs）的ILVs中，最终将其输送到溶酶体进行降解（Raiborg和Stenmark，2009；Katzmann等人，2001；MacDonald等人，2012）。此外，ESCRT还参与自噬、细胞分裂、膜修复以及病毒复制和出芽过程（Vietri等人，2020）。这些功能的核心机制是通过膜重塑实现的反向膜内陷（即从细胞质侧切割膜结构）（Sch?neberg等人，2017）。在ESCRT中，最终执行膜切割的机制是由ESCRT-Ⅲ介导的（Babst等人，2002；Stuchell-Brereton等人，2007；Shestakova等人，2010）。ESCRT-Ⅲ的结构和功能高度保守，它起源于最接近的真核生物近亲——古菌Asgard的二元ESCRT-Ⅲ系统（Souza等人，2025）。ESCRT-Ⅲ由Vps20、Vps32、Vps24和Vps2亚基高度有序地组装而成，形成螺旋状丝状聚合物，这些聚合物内陷并包裹膜上的货物（Raiborg和Stenmark，2009；Babst等人，2002；Pfitzner等人，2020）。随后，ATP酶Vps4与Ist1-Did2和Vta1-Vps60复合体协同作用（Lottridge等人，2006；Nickerson等人，2006；Rue等人，2008；Clippinger等人，2024），增强了ESCRT-Ⅲ的解聚活性，从而促进了ESCRT的回收利用（Shestakova等人，2010；Ott等人，2018；Dvilansky等人，2024）。ESCRT-Ⅲ在真核生物中的膜重塑功能已被广泛研究。然而，在致病真菌中的相关实证研究较少。有报道称，ESCRT-Ⅲ在植物病原体的致病结构形成中起调节作用。在Aspergillus oryzae中，AoVps24对于液泡的形成是必需的，从而维持菌丝的伸长和分生孢子的产生（Tatsumi等人，2006）。在Ustilago maydis中，删除会导致内体成熟缺陷（Haag和Pohlmann，2017）。在Fusarium graminearum中，删除、、和会导致不同程度的生长缺陷（Xie等人，2019a；Xie等人，2019b）。在这里，我们重点研究了两种ESCRT-Ⅲ辅助蛋白Did2和Vta1。在Saccharomyces cerevisiae中，研究表明删除或会导致E类表型的减弱，表明ESCRT-Ⅲ的积累，这会阻碍MVBs的形成和货物的降解（Rue等人，2008）。此外，最近的研究表明Vta1参与病毒出芽和入侵（Yue等人，2025），并且与神经退行性疾病密切相关（Dvilansky等人，2024）。然而，除了U. maydis和F. graminearum外，其他致病真菌中尚未报道Did2或Vta1的存在。
由丝状真菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病对全球水稻生产和粮食安全构成了严重威胁（Hopkins，1966）。M. oryzae因其独特的感染机制和高遗传可操作性而常被用作研究致病真菌的模型生物（Ebbole，2007）。致病真菌的感染过程包括几个关键阶段：分生孢子形成、分生孢子萌发、附着器形成、侵入和侵袭性生长。这些阶段受到保守的信号转导途径的调控，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路（Xu和Hamer，1996；Jiang等人，2018）、钙信号通路（Nguyen等人，2008）、G蛋白信号通路（Xu和Hamer，1996；Adachi和Hamer，1998）以及雷帕霉素靶蛋白（TOR）信号通路（Xiao等人，2025；Shi等人，2021；Zhu等人，2023）。阐明控制M. oryzae致病性的分子机制，特别是通过这些信号级联反应，对于开发新型的针对性策略来控制这种毁灭性疾病具有重要意义。
值得注意的是，病原体感染的核心步骤，包括附着器膨压的建立和感染钉的形成，依赖于高效的自噬流动，而ESCRT-Ⅲ在这些过程中起着关键作用。然而，关于致病真菌中ESCRT对自噬影响的研究尚未充分展开。自噬是真核细胞中一种进化上保守的过程。自噬体是宏自噬的核心组成部分，其生成是一个严格调控的多阶段过程，包括起始、延伸和成熟。每个阶段都由不同的自噬相关（ATG）蛋白协调（Mizushima和Komatsu，2011；Cao等人，2021）。自噬体形成的一个关键未解之谜是自噬体闭合的机制。尽管尚未完全阐明，但ESCRT，特别是ESCRT-Ⅲ亚单位及其相关的ATP酶Vps4，已被证实是关键介导因子。有令人信服的证据表明，ESCRT-Ⅲ/Vps4定位于新形成的自噬体上，它们的功能缺失会导致自噬体闭合失败和自噬体积累（Takahashi等人，2018；Zhou等人，2019a；Zhen等人，2020）。这种在ESCRT缺陷细胞中的积累进一步暗示ESCRT可能在促进随后的自噬体-溶酶体融合中发挥作用（Feng等人，2020；Schmidt和Teis，2012）。有趣的是，在S. cerevisiae中的研究表明，ESCRT-Ⅲ通过与Atg17的相互作用被招募到吞噬体上（Zhou等人，2019b），这表明ESCRT的功能不仅限于闭合，还可能涉及自噬体生成的早期阶段。除了自噬体的闭合外，ESCRT还参与自噬体与溶酶体的融合（Feng等人，2020）、溶酶体损伤的修复（Tian等人，2025）以及哺乳动物中的内体微自噬的调控（Men等人，2025）。
我们之前的研究报道了ESCRT-Ⅲ辅助蛋白MoIst1在M. oryzae中的功能（Sun等人，2022a）。然而，M. oryzae中致病性与其他ESCRT-Ⅲ辅助蛋白之间的关联尚未被报道。在这项研究中，我们鉴定了M. oryzae中的Did2和Vta1，并发现它们参与营养生长、分生孢子形成、致病性、非生物胁迫反应和内吞作用。具体来说，删除Mo和Mo会导致分生孢子形成和致病性的丧失。此外，MoDid2和MoVta1参与Pmk1 MAPK通路和Osm1 MAPK通路，显示出对非生物胁迫的不同反应。MoDid2和MoVta1还在内吞作用和MoMsb2的降解中起关键作用。MoDid2也是自噬所必需的，而MoVta1则不是。总之，这项工作揭示了MoDid2和MoVta1在M. oryzae中的关键作用。这些结果为了解模型植物病原体中ESCRT复合体的功能提供了视角，从而确定了控制稻瘟病的潜在遗传靶点。
在M. oryzae中鉴定Did2和Vta1
ESCRT是真核细胞中重要的蛋白质货物分选器，在细胞膜重塑中发挥重要作用（Vietri等人，2020）。先前的研究在M. oryzae中鉴定了15个ESCRT亚单位，发现其中三个亚单位MoVps27、MoHse1和MoIst1参与营养生长、分生孢子形成、致病性和自噬（Sun等人，2022a；Sun等人，2022b）。为了进一步探索ESCRT的功能，我们从与其相互作用的蛋白质开始研究...
讨论
在这项研究中，我们鉴定了ESCRT-Ⅲ辅助蛋白MoDid2和MoIst1之间的相互作用，以及MoDid2和MoVta1之间的相互作用。这与S. cerevisiae和哺乳动物细胞中的先前研究结果一致（Lottridge等人，2006；Rue等人，2008；Hanson和Cashikar，2012），强调了Ist1-Did2复合体的保守性及其通过Vta1-Vps60复合体的辅助来增强Vps4解聚活性的作用。然而，我们没有检测到...
菌株和培养条件
使用M. oryzae菌株Guy11作为转化的野生型。菌株在含有所有营养物质的固体培养基（CM）上以25°C培养，光照时间为16小时，黑暗时间为8小时。为了提取RNA或蛋白质，菌株在含有氨基酸和硫酸铵的合成葡萄糖培养基（SD-N）中以25°C培养，并在150 rpm的转速下振荡36小时。根据具体实验需要选择不同的培养基：最小培养基（MM）用于量化营养生长；不含氨基酸和硫酸铵的合成葡萄糖培养基（SD-N）用于监测自噬。
CRediT作者贡献声明
Wang Zi-He： 数据管理。
Lin Li： 写作——审稿与编辑，方法学。
Wen-Hui Zhao： 数据管理。
Jin Zhao： 数据管理。
Li-Xiao Sun： 数据管理。
Xue-Ming Zhu： 写作——审稿与编辑，数据管理。
Jian Liao： 写作——初稿撰写，研究调查，数据管理，概念构建。
Irshad Ali Khan： 研究调查，数据管理。
Hong-Min Lv： 数据管理。
Xiao-Hong Liu： 写作——审稿与编辑，监督，资金获取。
Meng-Fan He： 数据管理。
致谢
我们想感谢参与这项研究的所有人员以及在我们撰写手稿过程中提供帮助的所有人士。
财务支持
本研究得到了中国国家自然科学基金（32270201）和中国国家重点研发计划（2023YFD1400202）的支持。
