《Microchemical Journal》：Facile fabrication of reproducible Ni
Ag SERS substrates via ultrasonic-assisted spin-coating
编辑推荐：
双模生物传感器通过整合电化学和光热检测模式，利用PNA探针和催化发夹组装（CHA）技术实现硫酸盐还原菌（SRB）DsrC基因的高灵敏度检测（电化学模式0.17 fM，光热模式0.66 fM），具有抗干扰强、信号放大高效、成本低且适用于复杂样本的特点。
张世琦|翟晓凡|杨静|马福斌|孙忠豪|朱鹏|段继洲|侯宝荣
中国科学院先进海洋材料国家重点实验室，中国青岛266071
摘要
硫酸盐还原菌（SRB）是微生物影响腐蚀（MIC）研究中最为广泛关注的微生物之一。开发有效、灵敏且成本效益高的SRB检测方法对于阐明腐蚀机制和实现及时腐蚀监测至关重要。在这项研究中，设计了一种新型双模式DNA生物传感器，用于特异性检测SRB中的DsrC基因。该生物传感器利用肽核酸（PNA）探针和催化发夹组装（CHA）技术，整合了电化学和光热信号模式，从而具备了出色的抗干扰能力和高效的信号放大效果。电化学模式的信号输出采用方波伏安法（SWV）电流，光热模式的信号输出采用温度变化。该生物传感器的检测限分别为0.17 fM和0.66 fM，表现出优异的选择性、稳定性和重复性。此外，该生物传感器成功检测到了从实际样品中分离和提取的DsrC基因片段，证明了其良好的实用性。与现有技术相比，这种双模式生物传感器具有更宽的检测范围和更低的检测限，为敏感且特异性地检测腐蚀微生物提供了有前景的新方法。
引言
微生物影响腐蚀（MIC）是由微生物在金属材料上的定殖或代谢活动引起的[1]，据估计约占所有金属腐蚀的20%[2]。在参与MIC的微生物中，硫酸盐还原菌（SRB）被广泛认为是导致严重腐蚀的主要物种[3]，常见于土壤、河流和海洋系统等多种环境中。SRB产生的代谢物可以引发并加速工程材料的腐蚀，给石油和天然气行业带来重大挑战[4]。检测微生物对于阐明腐蚀机制和实施及时缓解策略至关重要。传统的SRB检测方法主要包括最可能数（MPN）法[5]、聚合酶链反应（PCR）法[6]、酶联免疫吸附测定（ELISA）法[7]和荧光原位杂交（FISH）法[8]。然而，这些技术存在一些局限性，如检测时间长、准确性有限以及检测成本高[9]。因此，迫切需要高效、灵敏且经济可行的SRB检测方法。生物传感器通过将固定的生物识别元件与合适的换能器结合，具有高选择性和灵敏度、快速分析以及低成本等显著优势[10]。迄今为止，已经开发出用于检测SRB的各种生物传感器，包括基于特征代谢物[11]、生物膜活性[12]和基因识别[13][14]的生物传感器。在这些复杂的微生物群落中，基于基因识别的检测方法表现出优异的灵敏度和特异性。特别是SRB的异化亚硫酸盐还原酶亚基C（DsrC）作为氧化还原中心，具有高度的特异性[15]，使其成为理想的检测目标。
然而，与传统DNA生物传感器通常依赖的单模式检测相比，单模式检测容易受到信号干扰，从而限制了选择性和灵敏度[16]。最近，双模式检测引起了广泛的研究兴趣。通过结合两种模式的优点并进行交叉验证，双模式系统可以减少外部因素的干扰，提高检测的精确度、准确性和可靠性[17]。例如，Li等人[18]开发了一种电化学发光（ECL）和荧光双模式生物传感器，用于检测miRNA-21，其检测限分别达到1.40 pM和0.18 pM。同样，Shi等人[19]基于电化学/比色双模式传感平台实现了对miRNA-21的灵敏检测，检测限分别为35.1 aM和61.6 aM。尽管如此，双模式方法仍面临操作复杂性和应用场景限制等挑战。为了解决这些问题，光热传感作为一种极具前景的补充模式应运而生。光热传感通过光热效应将光信号转换为可量化的热信号[20]，使得使用温度计等便携设备进行检测成为可能，大大降低了操作复杂性并促进了现场快速分析[21]。此外，光热检测具有较低的背景信号和改善的信噪比[22][23]，使其适用于复杂样品。更重要的是，其出色的时空分辨率使得光热模式能够与其他检测模式协同使用。例如，将光热传感与电化学生物传感器结合，可以利用两种技术的互补优势。虽然电化学模式具有广泛的适用性、快速响应时间和成本效益[24]，但在复杂的生物或环境样品中，非特异性吸附可能会影响目标分析物的精确和高灵敏度检测[25]。相比之下，光热传感具有简单的信号读出方式，并且依赖于光热效应，不受界面电子转移和溶液导电性的影响，因此不易受到环境背景的影响[26]。因此，基于电化学-光热双模式的生物传感器在食品安全检测、环境监测和临床诊断等领域表现出优异的性能[27]。例如，Tang等人[28]开发了一种双模式光热-电化学生物传感器，用于miRNA检测，检测限低至0.3 fM和0.32 fM。为了进一步提高光热-电化学双模式生物传感器的灵敏度和稳定性，开发新型高效功能材料和改进检测策略至关重要。
最近，为了提高生物传感器的稳定性，将肽核酸（PNA）探针引入检测系统。肽核酸（PNA）是一种由重复的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元通过肽键连接而成的合成核酸类似物[29]。由于其电中性骨架，PNA链比DNA更耐酶降解[30]。更重要的是，PNA的刚性使其能够在电极表面保持扩展构象，有效减少静电相互作用引起的非特异性吸附[31]。与DNA探针相比，基于PNA的杂交体具有更高的热稳定性[32]。例如，Liu等人[33]开发了一种使用PNA修饰的纳米复合材料作为电化学传感器来检测TP53基因，检测限达到0.26 pM。因此，用PNA替换DNA探针可以提高生物传感器电化学组分的整体稳定性和抗干扰能力。此外，DNA在电极界面上的合理自组装可以增加探针负载并改善电子转移路径，从而实现超高的灵敏度和低检测限[34][35][36]。催化发夹组装（CHA）是一种可以与功能性信号报告器结合的自组装策略。无酶的等温CHA反应通过单链DNA的自主组装高效促进发夹DNA探针的杂交[37]。PNA和CHA过程的结合可以生成高度有序的三向结（TWJ）纳米结构，这些结构可以锚定在修饰的电极表面上[38]，促进双链结构的形成。据报道，这些结构对电活性染料亚甲蓝（MB）具有强亲和力，导致MB的显著积累。重要的是，TWJ支架还是近红外（NIR）吸收染料吲哚菁绿（ICG）的高容量载体。ICG在NIR照射下的高效光热转换会产生显著的局部温度升高[39]。MB和ICG的负载显著增强了信号响应，使其远高于背景水平，从而显著提高了检测灵敏度和可靠性。然而，PNA探针用于增强稳定性、CHA用于信号放大以及ICG作为光热换能器的双模式生物传感器的协同整合仍需进一步探索。
基于上述研究，我们开发了一种电化学-光热双模式生物传感器，将PNA探针与CHA结合，以实现SRB DsrC基因的高特异性和超灵敏检测。生物传感器的制备过程如图1所示。首先，通过Au-S键将PNA探针固定在Au/ITO电极表面。利用CHA的级联放大作用，PNA探针选择性地捕获目标片段引发的CHA产物，最终形成PNA-DNA TWJ结构，从而实现显著的信号放大。随后分别使用MB和ICG作为电化学和光热报告探针。在808 nm激光照射下，系统的方波伏安法（SWV）电流响应和温度变化作为双模式信号输出，用于检测目标基因。该双模式平台实现了极低的DsrC目标检测限。所开发的方法无需昂贵设备，同时表现出高选择性和稳定性。通过实际样品测试进一步验证了检测准确性，证明了其在实际应用中的巨大潜力。
生物传感器制备
生物传感器的制备
采用基于先前研究的略微改进的方法，将Au电沉积到氧化铟锡（ITO）电极上[40]。具体步骤如下：首先，将ITO电极超声清洗15分钟，然后在温和的氮气流下干燥。清洗后，将电极置于含有1 mM HAuCl4和0.2 M Na2SO4的水电解液中，进行循环伏安法（CV）测试，电位范围为0至?1.5 V（相对于Ag/AgCl），扫描速率为100 mV?s?1。之后，采用恒电位法进行反应。
电极和材料的表征
系统地表征了电极和材料的形态、结构和性能。制备的Au/ITO电极的表面形态通过场发射扫描电子显微镜（FESEM）进行观察。与ITO电极（图S1A）相比，沉积的AuNPs在ITO表面上以颗粒状分布（图1A）。使用能量色散光谱（EDX）对电极表面进行元素分析（图S1B）。
结论
总体而言，开发了一种新型双模式生物传感器，用于超灵敏地检测SRB DsrC基因。该生物传感器结合了CHA级联放大和电化学及光热模式，实现了高灵敏度和特异性。检测过程利用固定在Au/ITO电极表面的PNA探针捕获目标基因引发的CHA产物。与MB和ICG孵育后，进行了分析性能测试，包括SWV电流等。
CRediT作者贡献声明
张世琦：撰写——原始草稿、软件开发、方法论设计、实验研究、数据分析。翟晓凡：撰写——审稿与编辑、验证、项目管理、方法论设计、资金获取、概念构思。杨静：验证、软件开发、实验研究、数据分析。马福斌：项目管理、资金获取。孙忠豪：软件开发、实验研究。朱鹏：撰写——审稿与编辑、数据可视化、项目监督。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了中国科学院战略性优先研究计划（XDB1210302）、山东省科技厅海洋科学技术国家重点实验室（青岛）文海计划（2021WHZZB2305）、山东省重点研发计划（2023CXPT008）、山东省自然科学基金（ZR2025QA03和ZR2022MD023）、山东省泰山学者计划（tsqn202507295）以及国际合作的支持。
