《Mitochondrion》：From variant interpretation to structural discovery: A new Zinc-binding domain in PARS2
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本研究旨在解决线粒体氨酰-tRNA合成酶（ARS2）新发变异临床意义评估及功能结构域解析的难题。作者通过对两名携带PARS2新变异的癫痫性脑病患儿的深入研究，结合蛋白质结构建模和进化保守性分析，首次在哺乳动物线粒体脯氨酰-tRNA合成酶（PARS2）中鉴定出一个关键的锌结合域（ZBD）。该发现不仅为相关疾病的遗传诊断提供了新依据，还揭示了ARS2家族蛋白中未被充分认识的保守功能结构，具有重要的临床和基础研究意义。
在我们身体的每个细胞里，微小的“能量工厂”——线粒体正日夜不停地工作，合成生命活动必需的ATP（三磷酸腺苷）。这个复杂过程中的一个核心步骤，依赖于一组名为氨酰-tRNA合成酶（Aminoacyl-tRNA synthetases， aaRSs）的关键酶。它们负责将正确的氨基酸连接到对应的转运RNA（tRNA）上，这是蛋白质合成准确无误的基石。在细胞质和线粒体中，存在着功能相同但由不同基因编码的两套aaRSs系统，其中线粒体版本被称为ARS2。当编码这些酶的基因发生致病性变异时，常会导致一系列严重的神经系统疾病，给家庭带来沉重的负担。
然而，精准诊断这些疾病并非易事。其中一个主要障碍是，我们对线粒体ARS2蛋白的“额外”功能域（即在催化核心之外的进化获得性区域）知之甚少。这些区域在不同物种间往往保守性差，导致一些新发现的基因变异容易被现有的计算机预测工具（in silicopredictors）判定为“意义不明”甚至“可能良性”，从而延误诊断。本研究关注的线粒体脯氨酰-tRNA合成酶（PARS2）就面临着这样的挑战。由PARS2基因双等位基因变异导致的PARS2缺乏症，临床上主要表现为婴儿期起病的药物难治性癫痫性脑病、小头畸形和脑萎缩，预后不良。在诊断两名临床症状高度疑似但携带一个意义不明新变异的患儿时，研究人员决定追根溯源，他们的探索最终揭示了一个意想不到的结构秘密，相关成果发表在《Mitochondrion》期刊。
为了完成这项研究，作者团队主要运用了以下几项关键技术方法：首先，利用外显子组测序（exome sequencing）结合ACMG（美国医学遗传学与基因组学学会）指南对两名先证者及其家系成员进行基因变异鉴定与验证。其次，通过Western blot（蛋白质印迹）分析患者来源成纤维细胞中PARS2蛋白的表达水平。在生物信息学分析方面，研究者构建了包含126个不同物种脯氨酰-tRNA合成酶序列的多重序列比对，并结合分支特异性（clade-specific）保守性分析来精细评估变异区域的进化约束。核心的结构生物学方法则包括利用AlphaFold生成的同源模型以及已知的晶体结构（如人源胞质双功能GluProRS， PDB#4HVC），通过PyMOL进行蛋白质三维结构的比较建模（comparative protein-structure modeling），以预测和分析新发现结构域的空间构象与功能。
3.1. 通过外显子组测序在两名患者中鉴定出PARS2变异
研究人员在两名不相关的、患有全面性发育迟缓、癫痫和小头畸形的患儿中，通过外显子组测序发现他们都复合杂合携带两个PARS2基因变异：一个是先前报道过的c.1091C>G， p.(Pro364Arg)变异；另一个则是新发现的c.877C>G， p.(Pro293Ala)变异。Sanger测序证实了变异，且父母各为其中一个变异的杂合携带者。这两个变异分别位于PARS2蛋白的催化结构域以及与反密码子结合域（AC-BD）连接的铰链区。
3.2. 生化分析
对患者成纤维细胞和其中一名患者肌肉组织的呼吸链复合体活性进行分光光度法测定，未发现氧化磷酸化（OXPHOS）复合体活性缺陷。极谱法测定完整细胞和经洋地黄皂苷（digitonin）透化的细胞线粒体底物氧化能力，也未发现异常。
3.3. Western blot分析
通过Western blot检测患者成纤维细胞中PARS2蛋白的表达水平，结果显示与对照组相比，两名患者的蛋白表达量未见明显变化。
3.4. 揭示哺乳动物线粒体脯氨酰-tRNA合成酶中的一个锌结合域
新变异p.(Pro293Ala)被归类为“意义不明”（VUS），促使研究人员更深入地分析了293位脯氨酸的保守性。尽管在全局多重序列比对中该区域似乎不受约束，但在哺乳动物线粒体ProRS（PARS2）这一特定分支中，该脯氨酸残基以及附近的四个半胱氨酸（Cys273， Cys276， Cys292， Cys295）被严格保守。结构模型显示，这四个半胱氨酸的空间取向与四配位结合一个锌原子（Zinc atom）的构象高度兼容，而相邻的保守脯氨酸（Pro274和Pro293）可能通过其独特的构象刚性加强了这一结构。有意思的是，在哺乳动物胞质脯氨酰-tRNA合成酶（ProRS）中，一个功能至关重要的C端锌结合域（ZBD）近期被证实。通过将人源线粒体PARS2的AlphaFold模型与胞质ProRS的晶体结构进行叠加比较，研究人员发现两者在空间上具有惊人的结构相似性，ZBD的空间位置几乎完全一致，尽管它们在序列上的位置不同。这表明，在哺乳动物线粒体ProRS中，一个先前未被认识的ZBD以类似的方式存在。
3.5. 文献综述：临床与分子数据
通过对已报道病例的系统回顾，共汇总了22名携带PARS2致病性变异的患者（加上本研究两名，共24名）的临床和分子数据。患者主要表现为早发性癫痫性脑病、小头畸形、脑白质营养不良/脑萎缩等。已报道的15种不同变异遍布PARS2蛋白除N端线粒体靶向序列外的所有结构域。
本研究报道了两名携带PARS2变异（包括新变异p.Pro293Ala）的新患者，其临床表现与先前报道的PARS2缺乏症患者高度一致，支持了该新变异的致病性。p.Pro364Arg变异虽在人群中频率相对较高且计算机预测结果存在矛盾，但综合其在患者中的富集情况、所处关键结构位置（催化域与反密码子结合域的铰链区）以及导致的电荷与空间构象剧变，应被视为明确致病变异。而研究最重要的发现，在于通过对p.Pro293Ala所在区域的深入分析，首次在哺乳动物线粒体脯氨酰-tRNA合成酶（PARS2）中揭示了一个之前未被认识的锌结合域（ZBD）。
这一发现具有多重重要意义。首先，在临床诊断层面，它解释了为何基于全局物种保守性的标准预测工具会错误地将p.Pro293Ala归类为良性或意义不明，因为该ZBD仅在哺乳动物分支内高度保守。这凸显了在评估ARS2变异时，结合分支特异性（clade-specific）序列保守性分析与蛋白质结构建模的极端重要性，为未来类似病例的精准诊断提供了方法论范例。其次，在基础生物学层面，这一发现挑战了之前的认知。哺乳动物线粒体ProRS起源于细菌，但丢失了细菌同源物中常见的编辑结构域（Editing domain），其残余序列曾被认为是进化留下的“疤痕”（evolutionary scar）。本研究证明，这段序列在哺乳动物中已“废物利用”，进化形成了一个关键的ZBD。其与哺乳动物胞质ProRS中已被证实功能必需的ZBD在空间结构上的惊人相似性，强烈暗示该结构域对于PARS2的催化活性或稳定性同样至关重要，为理解线粒体蛋白质合成机器的精细调控开辟了新视角。最后，本研究拓展了PARS2相关疾病的基因型谱和表型谱，为该疾病的遗传咨询和患者管理提供了更全面的信息。总之，这项研究完美诠释了如何从临床诊断的挑战出发，通过多学科方法的深度融合，导向对生命基本过程的基础性新发现。
