《Molecular & Cellular Proteomics》：An Evolutionary Distinct Nipah Virus N-Glycosylation Site Provides Stability for Receptor Engagement
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本文研究旨在解决Nipah病毒附件糖蛋白（G蛋白）N-糖基化的功能未知问题。研究人员通过系统发育、糖蛋白质组学、氢氘交换质谱和生物层干涉技术，揭示了Nipah G蛋白N481糖基化位点的进化不保守性及其邻近残基T483通过氢键网络稳定受体结合环的关键作用。该发现阐明了糖基化位点变异如何影响蛋白质构象动力学与受体（ephrin B2）结合亲和力，为理解病毒附着机制及基于结构的疫苗设计提供了新思路。
尼帕病毒（Nipah virus）是一种致命的人畜共患副黏病毒，自1998年首次暴发以来，已导致超过750例感染，死亡率高达40-75%。目前，临床上尚无批准的疫苗或治疗方法来应对这种感染。这种病毒的表面镶嵌着两种糖蛋白：三聚体的融合糖蛋白（F）和四聚体的附着糖蛋白（G）。其中，G蛋白负责通过与宿主细胞表面的受体ephrin B2/B3结合，介导病毒与细胞的初始附着。蛋白质的糖基化（即添加糖链）能够显著影响其免疫原性、受体结合能力和结构构象。然而，糖基化如何影响尼帕病毒G蛋白与受体的结合，此前尚缺乏深入的研究。理解这一过程对于揭示病毒的入侵机制和开发有效的干预措施至关重要。
为了回答上述问题，来自英国罗莎琳德·富兰克林研究所的Tia E. Hawkins、Valeria Calvaresi、Sean A. Burnap、Yana Demyanenko、Liang Wu和Weston B. Struwe团队在《Molecular》杂志上发表了一项研究。他们综合运用了多种前沿技术，包括系统发育分析、质谱技术（如糖组学、糖蛋白质组学和氢氘交换质谱）、质量光度法和生物层干涉技术，对尼帕病毒G蛋白（马来西亚毒株）的N-糖基化进行了深入探究，旨在揭示特定糖基化位点如何调控蛋白质的结构动力学、稳定性及其与受体的相互作用。
本研究主要采用了以下关键技术方法：首先，对来自NCBI病毒数据库的81个尼帕病毒G蛋白分离株进行系统发育分析，以追踪糖基化位点的进化。其次，利用质谱技术（包括离子淌度质谱/串联质谱和液相色谱）对重组表达的G蛋白胞外域进行全面的N-糖链和O-糖链的位点特异性鉴定与定量分析。接着，通过定点突变技术（将N-X-S/T糖基化序列中的丝氨酸/苏氨酸突变为丙氨酸）构建了多个糖基化位点敲除的G蛋白突变体。然后，使用生物层干涉技术精确测量了这些突变体与受体ephrin B2的结合亲和力。最后，借助氢氘交换质谱技术，比较了野生型G蛋白头部结构域、关键突变体（N481D和T483A）在结合或不结合ephrin B2时的构象动力学变化。
研究结果
1. 尼帕病毒G蛋白N-糖基化的系统发育分析
研究人员对来自四个不同宿主物种、五个国家的81个尼帕病毒G蛋白完整序列进行了分析。结果显示，尼帕病毒已分化为马来西亚毒株和孟加拉国毒株（分别对应进化枝I和II）。值得注意的是，在七个预测的N-糖基化位点中，有六个在所有进化枝中都是保守的。然而，一个特定的突变（N481D）导致了N481糖基化位点的丢失。这一突变事件的发生独立于宿主和地理起源，表明它可能受到特殊的进化压力。
2. 尼帕病毒G蛋白的位点特异性糖基化
研究首次对尼帕病毒G蛋白胞外域进行了全面的位点特异性糖链分析。通过糖蛋白质组学等方法，他们绘制了七个N-糖基化位点（N72， N159， N306， N378， N417， N481， N529）的糖链类型和丰度图谱。研究发现，N481位点几乎完全被寡甘露糖型糖链占据（约74.2%），且是唯一一个几乎没有复杂型糖链（<1%）的位点。此外，研究还鉴定并定位了G蛋白茎部区域的八个O-糖基化位点。这些糖基化修饰的空间分布提示它们可能直接或变构地影响受体结合。
3. 尼帕病毒G蛋白糖基化位点突变体的受体结合
为了探究糖基化对受体结合的影响，研究团队构建了一系列单点糖基化位点敲除突变体（如T308A， S380A等），并测量它们与ephrin B2的结合亲和力。结果显示，与野生型相比，T483A突变体（导致N481位点糖基化丧失）与ephrin B2的结合亲和力显著降低了约3.7倍。有趣的是，同样是导致N481糖基化丧失的自然进化突变体N481D，其结合亲和力仅轻微下降，与T483A有显著差异。这表明，结合亲和力的降低并非单纯由N481位点糖链的缺失引起，而更可能与T483残基本身的突变相关。
4. 尼帕病毒G蛋白与ephrin B2复合物的结构动力学
为了从结构层面理解上述现象，研究人员利用氢氘交换质谱比较了野生型、N481D和T483A突变体在结合或不结合ephrin B2时的构象柔性。HDX-MS数据揭示，与野生型相比，T483A突变体在包含突变位点在内的一个关键环状区域（残基T471-F496）显示出显著的氢氘交换增加，表明该区域的结构变得更为动态或不稳定。而这个区域（特别是N482-F496片段）在受体结合时通常会变得稳定（氢氘交换减少）。N481D突变体对该区域动态性的影响则小得多。这解释了为何T483A对受体结合的影响比N481D更大。
研究结论与讨论
本研究鉴定出尼帕病毒G蛋白上一个涉及N-糖基化序列（N481-X-T483）的保守脆弱区域，该区域对受体结合有重要影响。在病毒进化过程中，该序列中的N481残基突变成了D481，但其后的十六个氨基酸（包括T483）在所有尼帕病毒进化枝及亨德拉病毒主要毒株中都100%保守。这些残基形成了一个结构化的环，该环在结合ephrin B2时会变得稳定。HDX-MS数据显示，这种稳定作用定位于N482-F496残基区域。
关键发现在于，T483的羟基与N543的侧链羰基之间形成了一个氢键网络。将T483突变为丙氨酸（T483A）会破坏这个氢键，导致该结合环发生构象重排，从而降低与ephrin B2的亲和力。相比之下，自然发生的N481D突变对这个环的构象动力学和受体结合影响很小，理论上不会显著影响病毒的感染潜力。因此，T483残基（而非其连接的糖链）对于维持G蛋白受体结合界面的局部稳定性至关重要。
此外，这是首次对尼帕病毒G蛋白进行的位点特异性糖链分析。研究发现，N481位点富含寡甘露糖型糖链，这类糖链可能与先天免疫识别有关。该糖基化位点在进化上的不保守性（N481D突变）可能与增强病毒融合能力有关，暗示此区域可能也参与了与F蛋白的相互作用。
总之，这项工作揭示了Nipah病毒G蛋白上一个关键糖基化位点（N481）的进化可塑性及其相邻残基（T483）通过氢键网络稳定受体结合环的分子机制。这些发现不仅增进了我们对病毒附着和进入机制的理解，而且为基于结构的疫苗和治疗方法（如靶向该稳定环的单克隆抗体）的设计提供了重要的理论依据和潜在的干预靶点。
