大鼠μ阿片受体基因外显子1与11相关变体对丁丙诺啡和吗啡镇痛及呼吸抑制影响的差异研究

《Molecular Pharmacology》：Differential impacts of exon 1-associated and exon 11-associated variants of the rat mu opioid receptor gene, Oprm1, on buprenorphine- and morphine-induced analgesia and respiratory depression in male rats

本研究通过CRISPR/Cas9技术构建大鼠Oprm1基因外显子1(E1)与11(E11)靶向敲除模型，首次系统揭示了E1和E11相关变体在丁丙诺啡和吗啡的镇痛与呼吸抑制中的作用差异。结果表明，丁丙诺啡的镇痛和呼吸抑制作用依赖于E1和E11相关变体，而吗啡的效应仅依赖于E1相关变体。这一发现为理解丁丙诺啡和吗啡药理作用的分子机制提供了重要新见解，并为基于μ阿片受体变体的精准镇痛和呼吸安全调控提供了潜在靶点。

　　

丁丙诺啡是一种独特的阿片类药物，既是μ阿片受体的部分激动剂，也是κ和δ阿片受体的拮抗剂，同时还作用于痛敏肽/孤啡肽受体(NOP)。与吗啡等完全激动剂相比，丁丙诺啡具有较低的呼吸抑制和滥用风险，因此被广泛用于阿片使用障碍的治疗。然而，即便是相对安全的丁丙诺啡，在与苯二氮?类镇静剂合用时仍可能引发严重的呼吸抑制。问题的核心在于，丁丙诺啡这种复杂且独特的药理作用是如何在分子层面实现的？

μ阿片受体基因(OPRM1)在从啮齿类到人类中均存在广泛的选择性剪接，产生一系列剪接变体。这些变体主要可分为两大类：外显子1(E1)相关变体和外显子11(E11)相关变体。E1相关变体主要为全长7次跨膜(7TM)的C-末端变体，构成了传统意义上的μ阿片受体；而E11相关变体主要为缺少第一个跨膜区的截短6次跨膜(6TM)变体。先前在小鼠中的研究发现，丁丙诺啡的镇痛作用同时依赖于E1和E11相关变体，而吗啡的镇痛作用仅依赖于E1相关变体。然而，这两种变体在丁丙诺啡和吗啡诱导的镇痛及呼吸抑制中的作用在大鼠模型中是否一致，以及它们在呼吸抑制这种关键副作用中扮演的角色，此前尚不明确。为了填补这一空白，并利用大鼠在神经科学和行为研究中的优势，研究人员在大鼠模型中开展了此项研究，论文发表于《Molecular Pharmacology》。

为了探究大鼠Oprm1基因E1和E11相关变体的功能，研究人员主要采用了CRISPR/Cas9基因编辑技术。他们分别构建了E1条件性敲除(floxed, rE1^f/f)和全身性敲除(KO, rE1^d/d)大鼠模型，以及E11条件性敲除(rE11^f/f)和全身性敲除(rE11^d/d)大鼠模型。所使用的动物样本分别来自Charles River Laboratories的Crl:CD(SD)大鼠和CLEA Japan, Inc.的Jcl:SD大鼠。通过RT-qPCR和放射性配体结合实验验证了模型的有效性。随后，使用辐射热甩尾试验评估药物镇痛效果，并使用RatOx脉搏血氧仪系统在清醒、自由活动的大鼠中测量血氧饱和度，以量化呼吸抑制程度。

3.1. 大鼠Oprm1外显子1 (E1)和外显子11 (E11)基因靶向模型的建立与鉴定**

研究人员成功利用CRISPR/Cas9技术结合长单链DNA(lssDNA)模板，构建了rE1^f/f/rE1^d/d和rE11^f/f/rE11^d/d大鼠模型。RT-qPCR结果显示，敲除模型中相应的变体mRNA表达缺失。放射性配体结合实验表明，rE1^d/d大鼠脑中完全丧失了与[³H]DAMGO（一种μ阿片受体完全激动剂）的结合能力，证明E1相关变体编码了功能性的7TM μ阿片受体。而rE11^d/d大鼠的[³H]DAMGO结合参数与野生型无显著差异，说明E11相关变体的缺失不影响7TM受体的表达与结合特性。δ和κ阿片受体的表达在所有模型中均未受影响。

3.2. 丁丙诺啡镇痛依赖于E1相关和E11相关变体

累积剂量-反应曲线显示，在野生型和floxed对照大鼠中，丁丙诺啡能有效产生镇痛。然而，在rE1^d/d大鼠中，丁丙诺啡的镇痛作用完全丧失。在rE11^d/d大鼠中，丁丙诺啡的镇痛效能显著降低，其半数有效剂量(ED₅₀)值大幅升高，且最大镇痛效应(%MPE)也显著减弱。这表明丁丙诺啡的镇痛作用同时需要E1和E11相关变体，但E1相关变体起主导作用。

3.3. 吗啡镇痛依赖于E1相关变体但不依赖于E11相关变体

与丁丙诺啡不同，吗啡的镇痛作用在rE1^d/d大鼠中完全消失，但在rE11^d/d大鼠中则完全保留，其ED₅₀值与对照组无统计学差异。这清晰地证明吗啡的镇痛作用仅由E1相关变体（即全长7TM受体）介导，不依赖于E11相关变体。

3.4. 丁丙诺啡诱导的呼吸抑制依赖于E1相关和E11相关变体

使用脉搏血氧仪监测发现，大剂量丁丙诺啡能在rE1^f/f和rE11^f/f大鼠中引起血氧饱和度显著下降（约10%）。但在rE1^d/d大鼠中，丁丙诺啡完全不能引起呼吸抑制。在rE11^d/d大鼠中，丁丙诺啡引起的呼吸抑制程度显著低于对照组。这说明丁丙诺啡的呼吸抑制作用也同时需要E1和E11相关变体参与，E1变体作用更为关键。

3.5. 吗啡诱导的呼吸抑制仅依赖于E1相关变体，不依赖于E11相关变体

大剂量吗啡在rE1^f/f和rE11^f/f大鼠中均引起强烈的呼吸抑制（血氧饱和度下降25-30%）。在rE1^d/d大鼠中，吗啡的呼吸抑制作用完全消失。然而，在rE11^d/d大鼠中，吗啡仍能引起与对照组程度相似的强烈呼吸抑制。这再次证实吗啡的呼吸抑制作用仅由E1相关变体介导。

归纳研究结论和讨论

本研究成功构建了大鼠Oprm1基因的E1和E11靶向模型，并首次在大鼠中系统阐明了这两种变体对丁丙诺啡和吗啡镇痛与呼吸抑制作用的差异依赖性。核心结论是：丁丙诺啡的镇痛和呼吸抑制作用同时依赖于E1相关的全长7TM变体和E11相关的截短6TM变体；而吗啡的镇痛和呼吸抑制作用仅依赖于E1相关的7TM变体，与E11变体无关。

这一发现具有多重重要意义。首先，它从受体剪接变体的层面，为理解丁丙诺啡独特且复杂的“部分激动剂”药理特性提供了分子机制的新见解。丁丙诺啡可能需要同时作用于7TM/6TM异源二聚体或通过更复杂的变体间相互作用来发挥其效应。其次，研究结果强调了μ阿片受体不同剪接变体在介导药物特异性效应中的关键作用，这为开发副作用更小、更具选择性的新型阿片类镇痛药指明了潜在靶点。例如，靶向6TM变体的药物（如IBNtxA）已被证明能有效镇痛且副作用少，本研究的机制支持了这一策略的合理性。最后，研究证实了丁丙诺啡在等效镇痛倍数剂量下，其引起的呼吸抑制程度远低于吗啡，这为其临床相对安全性提供了实验依据。同时，研究也警示了丁丙诺啡与中枢抑制剂合用时，通过E1和E11变体介导的呼吸抑制风险仍然存在。

未来的研究需要深入探索7TM与6TM变体相互作用的精确分子机制，并考察这些发现在雌性动物及其他行为（如成瘾、耐受）中的普适性。总之，这项研究不仅提供了宝贵的大鼠遗传学工具，更重要的是深化了我们对阿片类药物作用特异性的理解，为迈向更安全、精准的阿片类药物疗法奠定了重要的科学基础。