《Physiological Reports》：Mustn1 ablation in male mice results in fiber type and gene expression alterations during skeletal muscle regeneration
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我们推荐此研究，该研究利用条件性敲除Mustn1基因的Pax7-Cre小鼠模型，结合心脏毒素诱导的胫骨前肌损伤，系统揭示了Mustn1在骨骼肌再生过程中调控肌纤维类型转换、卫星细胞（Pax7+细胞）动力学及关键成肌基因（如MyoD、Myh4、Des、Cadh等）表达时序的关键作用，提示其作为肌肉修复过程的精细调节因子。
1 引言
骨骼肌是一种动态组织，能够在损伤后再生，这一过程依赖于肌卫星细胞、细胞外基质组成以及调控和结构蛋白的高度协调作用。肌卫星细胞是静息的肌肉祖细胞，以Pax7为标记，在损伤时被激活以促进肌肉修复。有效的再生依赖于成肌分化标记物（如MyoD、MyoG）、结构蛋白（如Desmin、Myh4）以及细胞粘附/融合分子（如Cadh、Cap1、Cav3）的精确协调。Mustn1（Musculoskeletal, Embryonic Nuclear Protein 1）已成为参与骨骼肌发育的关键基因。它最初被鉴定为骨折修复过程中的差异表达基因，存在于整个肌肉骨骼系统中，并且受发育调控。更重要的是，它被认为是肌生成的关键调节因子。在小鼠中，Mustn1在骨骼肌发育和生长过程中表达，在3月龄时达到峰值。此外，Mustn1已被证明与卫星细胞标记物Pax7共定位，加强了其在卫星细胞和肌肉再生中的潜在作用。最近的研究也表明，Mustn1与Small muscle protein X-linked (SMPX)相互作用，共同促进成肌分化，并且Mustn1缺陷会延迟骨骼肌再生。本研究旨在阐明Mustn1缺失是否会导致损伤后骨骼肌再生的改变。使用心脏毒素诱导的肌肉损伤模型，我们通过功能、组织学和分子分析研究了野生型和Mustn1敲除小鼠的肌肉再生。
2 方法
所有动物护理和实验均按照机构动物护理和使用委员会批准的方案指南进行。动物房维持在21°C，50%湿度，12小时光照/12小时黑暗循环。所有小鼠均可自由获取标准饲料和水以及丰容材料。Mustn1敲除小鼠的生成和表征先前已由我们的实验室报道。野生型和Mustn1敲除雄性小鼠在麻醉后，使用29G针头将100微升10微摩尔的眼镜蛇心脏毒素注射到右腿的胫骨前肌中。选择胫骨前肌是因为其易于操作的空间位置以及已知的混合纤维类型。为了评估受伤腿的功能，在小鼠爬上一个0.5米、85度倾斜的梯子时计时。在心脏毒素注射前以及注射后第2、5和10天进行评估。小鼠在心脏毒素注射后2小时、第2、5和10天被处死，胫骨前肌在无菌条件下采集。肌肉样本放入TRIzol试剂中，使用电动组织匀浆器在4°C下匀浆以防止样品降解。根据制造商方案提取RNA，并使用ReadyScript cDNA合成Mix进行cDNA合成。定量PCR使用SYBR Green PCR预混液在LightCycler 480II上进行。每个基因进行四重复检测。为了组织学分析，小鼠在心脏毒素注射后2小时、第2、5和10天被处死。小鼠的下后腿被采集，包埋在OCT中，在液氮中冷冻，并以8微米厚度切片。切片然后用苏木精和伊红染色。肌纤维分型采用免疫荧光方案。三张切片用10%山羊血清封闭1小时。一抗在4°C孵育过夜，二抗在室温孵育1小时。使用带有DAPI的封片剂封片。一抗包括MHCI、MHCIIa、MHCIIb。未使用抗体识别IIx型纤维；它们保持未染色状态。使用Axio Scan.Z1显微镜成像，并使用Qupath中的像素分类对纤维类型进行量化。Pax7免疫荧光染色方案采用Wang等人的方法。简言之，三张切片用10%甲醛固定15分钟，并用0.2% Triton X-100在室温透化10分钟。切片然后用10%山羊血清封闭1小时，随后与一抗在4°C孵育过夜，二抗在室温孵育1小时。使用带有DAPI的封片剂封片。通过Qupath中的对象分类识别Pax7阳性细胞。为了测量肌肉横截面积，我们使用Qupath中荧光标记的单个肌纤维。具体而言，使用魔棒工具选择I型、IIa型和IIb型纤维作为注释并测量其面积。使用每组两只动物的三个组织学切片进行测量。最后，使用H&E染色的肌肉切片识别中央核纤维。使用Qupath中的网格功能将肌肉分割成几个部分，手动计数具有中央定位核的纤维。所有数据以点图形式呈现，中位数表示为中央线，须线包含95%置信区间。使用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性，并非所有数据都通过。因此，使用混合效应模型比较时间和基因型，不假设球形度。当发现显著效应时，使用Tukey多重比较检验确定差异。所有分析使用Prism软件在0.95的alpha水平上进行。
3 结果
3.1 骨骼肌形态学
心脏毒素注射前后第0、2、5和10天对胫骨前肌进行H&E染色，未发现野生型和Mustn1敲除小鼠之间存在主要的形态学差异。注射前骨骼肌在两种小鼠品系中看起来都完整，但注射后2小时，可以清楚地看到纤维退化，这种情况持续到第2天。到第5天和第10天，可以检测到肌纤维的再生，伴有大量中央定位的核。
3.2 肌肉横截面积和中央核纤维
作为再生指标的衡量，我们还测量了纤维横截面积和中央核纤维。对I型纤维横截面积的检查揭示了野生型和Mustn1敲除小鼠在第0天和第2天的变化。具体而言，在第0天和第2天，与野生型相比，Mustn1敲除小鼠的I型纤维横截面积有所增加。在IIa型或IIb型纤维的横截面积方面，在任何时间点均未观察到两种小鼠品系之间存在统计学显著变化。当我们检查中央核纤维时，在第10天观察到了统计学显著差异，野生型的数量是Mustn1敲除小鼠的两倍。
3.3 肌纤维类型
为了检查两种小鼠品系之间在再生过程中肌纤维类型是否存在任何结构差异，我们对心脏毒素注射前后的胫骨前肌进行了免疫荧光分析。对I型纤维的检查表明，在所有时间点，两种品系之间没有统计学显著差异，但在损伤后第10天，Mustn1敲除小鼠有约142%的增加趋势。对于IIa型纤维，我们也检测到了统计学显著差异；在损伤后第5天，Mustn1敲除小鼠与野生型小鼠相比显示出约42%的增加。相反，对于IIb型和IIx型纤维，我们发现情况相反；野生型小鼠在损伤后第10天显示出统计学上更高百分比的IIb型纤维，并在损伤后第2天显示出IIx型纤维的巨大增加。
3.4 Pax7阳性细胞
由于Mustn1基因修饰靶向卫星细胞，这些细胞在骨骼肌再生中起关键作用，并且Pax7可以作为肌生成受损的指标，我们也想监测Pax7的表达。在损伤后第2天和第10天，两种小鼠品系之间观察到了统计学显著差异，Mustn1敲除小鼠显示出更多的Pax7阳性细胞。在损伤后第5天，我们也观察到Mustn1敲除小鼠中Pax7阳性细胞更多的趋势，但数据不显著。
3.5 成肌基因表达
我们还调查了两种小鼠品系之间骨骼肌标记基因的表达是否存在任何差异。因此，我们研究了分化标记物MyoD、Myh4和Cap1，以及成熟肌肉标记物Des、Cadh的mRNA表达水平。最后，我们还监测了Mustn1的表达。MyoD的表达在对照和损伤后第2天在野生型小鼠中高于Mustn1敲除小鼠。相反，MyoD的表达在第5天在Mustn1敲除小鼠中更高。类似地，Myh4的表达在对照、第0天和损伤后第2天在野生型小鼠中高于Mustn1敲除小鼠。相反，Myh4的表达在第10天在Mustn1敲除小鼠中统计学上更高。对于Cap1，我们仅在对照样本中检测到野生型与Mustn1敲除小鼠相比表达量更高，而在第10天没有显著差异。但对于第0、2和5天，我们观察到Mustn1敲除小鼠的表达水平显著更高。对于Des，我们检测到在对照和第0天样本中野生型小鼠的表达水平显著增加，但在第2、5和10天样本中Mustn1敲除小鼠的表达水平反向增加。Cadh表达在野生型小鼠的对照、第0天和第2天样本中显著增加，但在第5天和第10天减少。最后，正如预期的那样，Mustn1在Mustn1敲除小鼠的每个时间点都显著降低。在野生型中，Mustn1表达在损伤后第2天似乎处于最高水平，这与卫星细胞激活和增殖的时间相吻合。
3.6 功能测试
为了评估上述任何变化是否导致野生型和Mustn1敲除小鼠损伤后骨骼肌功能的差异，我们使用了85度倾斜梯子攀爬测试。在两种小鼠品系中都观察到了攀爬步态的变化。在攀爬时，小鼠倾向于外展受伤的腿，将其大幅度抬起以在梯子上迈步。在任何时间点，两种小鼠品系之间没有统计学显著差异。此外，野生型小鼠在损伤后第二天比注射前爬得更慢，它们的攀爬时间在第5天和第10天减少，但没有恢复到注射前的时间。只有第10天与对照相比显示出统计学显著差异，攀爬时间减少了约35%。Mustn1敲除小鼠在对照和损伤后之间的攀爬时间没有显示任何统计学显著差异。
4 讨论
在本研究中，我们通过分析形态学变化、纤维类型组成、成肌基因表达和功能表现，研究了Mustn1缺失对骨骼肌再生的影响。我们的数据表明，尽管Mustn1缺失不会严重损害肌肉在损伤后的再生能力，但它似乎影响再生纤维的组成和成肌标记基因的时序表达。总的来说，这些结果表明Mustn1在骨骼肌再生中具有微妙但潜在重要的调节作用。
这并不奇怪，因为我们之前报道过Mustn1缺失会影响葡萄糖代谢、握力、步态、峰值收缩强度和肌纤维组成。最近，Fu等人也报道Mustn1敲除小鼠表现出肌肉质量和纤维横截面积减少，以及运动耐力下降和肌肉再生延迟。我们还显示，使用转基因小鼠，Mustn1在骨骼肌发育以及再生过程中起作用，在损伤后3天达到峰值，在第5天和第10天观察到水平下降，这与我们在此的结果一致。尽管有这些数据，我们没有观察到野生型和Mustn1敲除小鼠再生纤维整体形态的任何严重缺陷。两种品系在损伤后不久都表现出纤维退化，并在第5天和第10天开始再生，以中央定位的核为特征。虽然我们在两种小鼠品系之间没有检测到中央核纤维数量的差异，但在每种品系内部观察到了显著的时间差异。更重要的是，我们确实观察到Mustn1敲除小鼠在再生后期表现出更高比例的I型纤维和IIa型纤维，而野生型小鼠保留了更高百分比的IIb型和IIx型纤维。此外，Mustn1敲除小鼠在心脏毒素注射后第0天和第2天显示出I型纤维面积的显著增加。Mustn1敲除小鼠I型纤维横截面积的这种增加可能暗示了在缺乏Mustn1的情况下存在潜在的补偿机制或改变的再生反应。先前的研究已经确定，快缩纤维更容易受伤，但在正常情况下再生迅速。向氧化型纤维的转变表明Mustn1可能在维持或恢复损伤后的快缩表型中起作用。这与之前的研究结果一致，这些研究表明Mustn1在许多脊椎动物物种的骨骼肌肥大期间上调。
体外数据进一步证实了Mustn1在骨骼肌中的重要性。例如，我们之前报道Mustn1在成肌分化，特别是肌融合和肌管形成中起作用，这是再生肌纤维的关键过程。此外，据报道，Mustn1表达随着鸡骨骼肌卫星细胞的增殖而增加，其敲低导致Pax7、Cdk-2、MyoD、MyoG、MyHC和MyH1B的下调。而且，从Mustn1敲除小鼠分离培养的骨骼肌前体细胞表现出增殖、迁移、肌融合和分化受抑制。
我们的数据还表明，Mustn1缺失改变了骨骼肌再生过程中关键成肌标记物的表达模式。具体而言，我们观察到野生型小鼠在损伤早期通常表达更高水平的MyoD、Myh4、Des和Cadh，这与Mustn1在诱导成肌细胞分化和融合中的作用一致。Mustn1敲除小鼠这些标记物在早期时间点的延迟表达，随后在后期恢复，表明Mustn1可能对肌生成编程的时序激活很重要，特别是在卫星细胞中。这种时序失调可能是我们观察到的纤维类型谱改变的一个促成因素，并且可能部分解释了缺乏严重功能损伤的原因，因为肌肉再生最终会进行，但纤维类型组成略有不同。Hu等人和Fu等人的研究中也报告了这些和其他成肌分化标记基因的下调。这些结果表明Mustn1不是启动肌肉再生所绝对必需的，但可能影响该过程。
我们的功能测试，梯子攀爬，显示损伤后野生型和敲除小鼠之间没有显著差异，这与之前的报告一致，即骨骼肌的功能缺陷可能很微妙。值得注意的是，野生型小鼠与敲除小鼠相比，在早期时间点有功能恢复较慢的适度趋势，并且野生型小鼠仅在第10天才显示出显著恢复。这可能反映了我们数据表明的纤维类型再生的差异，并且与先前数据一致，即Mustn1敲低可以延迟但不会完全阻断体外的成肌细胞分化，表明其他补偿途径可能减轻体内的功能损失。
我们也确定了本研究的一些局限性，包括：样本量小；仅使用雄性小鼠；相对较短的随访期；功能测试在所有四肢上进行；以及仅使用单一的肌肉损伤模型。尽管如此，这项研究扩展了先前的工作，证明Mustn1缺失在体内改变肌纤维类型组成和成肌基因表达，而不会导致再生的严重缺陷。此外，我们的数据表明Mustn1充当调节剂，而不是肌肉再生不可或缺的因子。这与早期描述其作为软骨形成调节剂作用的工作一致。事实上，Ducommun等人报道Mustn1是一种分泌性微蛋白，可能基于对Mustn1缺陷小鼠肌肉的蛋白质组学分析揭示的细胞外基质组成差异来影响细胞外组成。最近，我们报道了Mustn1和Acta2在骨骼肌血管壁细胞中的强共定位。由于骨骼肌再生涉及显著的血管生成和细胞外重塑，可以设想Mustn1作为一种分泌蛋白，可能在这些过程中起作用。
与许多报道骨骼肌中Mustn1的研究相比，除了本文引用的那些之外，这些发现增加了我们对像Mustn1这样的调节基因如何通过微调或调节过程来塑造骨骼肌再生能力的理解。此外，先前的研究集中在核心转录因子如Pax7、MyoD和Myf5上，但较少研究可能影响再生时间安排和微调的调节因子的贡献，特别是纤维类型的发育和转换。我们的结果表明Mustn1就是这样一个因子，它的缺失可能影响再生朝向更氧化、抗疲劳的表型。进一步的研究可以确定靶向Mustn1是否在诸如肌肉营养不良或肌少症等需要增强氧化能力的情况下具有治疗意义。
最后，由于本研究中使用的小鼠是年轻的，我们的结果可能对儿科肌肉疾病的治疗具有临床意义。虽然没有明确的数据表明Mustn1在肌肉营养不良中的功能意义，但考虑到我们实验室的现有数据以及其他人的间接证据，这当然是可能的。例如，Balagopal等人报道，在四名患有杜氏肌营养不良的儿童中，氧雄龙治疗增强了MHC合成，随后减少了肌肉退化。更重要的是，Mustn1是杜氏肌营养不良肌肉中对氧雄龙反应下调的基因之一。在使用金毛猎犬肌肉营养不良犬模型的实验中，Robriquet等人报道，在移植骨骼肌驻留干细胞后，Mustn1是上调的基因之一，导致骨骼肌纤维再生的增强。总的来说，这些结果暗示Mustn1参与了此类儿科骨骼肌疾病。
