《The Plant Journal》：A Scots pine 4-coumarate:CoA ligase with high cinnamic acid affinity is the primary candidate for pinosylvin biosynthesis
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本研究报道了欧洲赤松中一种对肉桂酸具有异常高亲和力的4-香豆酰辅酶A连接酶（Ps4CL2），并证实其是松木酚生物合成通路中最后缺失的关键酶。该发现不仅解决了松木酚生物合成中肉桂酸激活步骤的长期疑问，也为理解4CL酶家族的底物特异性进化机制提供了新见解。
研究背景与松木酚的重要性
松木酚（pinosylvin, PS）及其单甲基醚是欧洲赤松心材中积累的防御性芪类化合物，能赋予木材抗病原体和抗腐朽的能力。虽然松木酚生物合成通路中的大部分酶已被鉴定，但将肉桂酸激活为肉桂酰辅酶A（cinnamoyl-CoA）这一关键步骤的催化酶却长期未知。与大多数植物利用4-香豆酸合成白藜芦醇的途径不同，松木酚的合成直接源自肉桂酸，该步骤推测由4-香豆酰辅酶A连接酶（4-coumarate:CoA ligase, 4CL）家族的某个成员负责。然而，典型的4CL通常优先催化羟基化或甲氧基化的肉桂酸衍生物，对肉桂酸本身的活性很低。另一种酶，肉桂酸辅酶A连接酶（cinnamate:CoA ligase, CNL）也催化此反应，但在裸子植物中未发现其存在的证据。本研究旨在从欧洲赤松中鉴定并表征负责松木酚生物合成中肉桂酸激活的酶。
4CL基因的鉴定、表达模式与系统发育分析
研究人员利用欧洲赤松在松木酚诱导条件（如心材形成、损伤和UV-C照射）下的转录组数据，鉴定出四个4CL亚型，分别命名为Ps4CL1、Ps4CL2、Ps4CL3和Ps4CL4。表达谱分析显示，Ps4CL2、Ps4CL3和Ps4CL4这三个基因的表达模式与松木酚合酶（PsSTS）和松木酚甲基转移酶2（PsPMT2）高度共表达，表明它们可能参与松木酚的合成。相比之下，Ps4CL1则与木质素生物合成相关基因共表达，暗示其功能不同。对已知CNL序列的搜寻未能在松木转录组或基因组中发现有意义的同源物，排除了CNL参与的可能性。
系统发育分析将植物4CL分为三类（Class I-III）。Ps4CL1与松属其他物种中参与木质素合成的4CL聚为一支。而Ps4CL2-4则形成了一个独特的进化支，属于裸子植物特有的Class III，其中Ps4CL2与火炬松中的一个未表征4CL形成了一个更小的分支，提示其可能具有特殊功能。已知的被子植物CNL则形成了一个完全独立的进化支。
Ps4CL2对肉桂酸表现出高催化效率与特异性
通过异源表达和蛋白纯化，研究人员测定了四个松木4CL以及拟南芥和树莓的对照4CL的酶动力学参数。结果发现，Ps4CL2对肉桂酸具有显著的高亲和力，其米氏常数（Km）仅为5.07 μM，远低于其他被测酶（如拟南芥At4CL1的Km为234.45 μM，树莓Ri4CL2为40.05 μM）。尽管Ps4CL2的催化速率（Kcat）不高，但其对肉桂酸的催化效率（Kcat/Km）最高，是拟南芥和树莓阳性对照的3-4倍。这表明Ps4CL2是高效且特异的肉桂酸激活酶。相反，其他松木4CL（Ps4CL1, 3, 4）更倾向于使用4-香豆酸作为底物，可能分别参与木质素和类黄酮的生物合成。
底物特异性由酶内多区域互作决定
为了探究Ps4CL2高肉桂酸亲和力的分子基础，研究者比较了序列相似度达90%但底物偏好迥异的Ps4CL2和Ps4CL3。序列比对和基于AlphaFold2的结构模型预测显示，两者在先前研究确定的底物结合区（Substrate-Binding Region, SBR）关键残基上几乎完全一致，仅在第263位存在一对相邻残基的差异：Ps4CL2为VF，而Ps4CL3为IY，其中酪氨酸（Y）被认为可通过π-π堆积与底物芳香环相互作用。
然而，点突变实验（将Ps4CL2的VF突变为IY，以及Ps4CL3的IY突变为VF）并未实现预期的底物偏好简单互换。突变影响了酶的催化速率（Kcat）或底物亲和力（Km），但并非单一决定因素。这表明这对残基虽然重要，但并非决定Ps4CL2高肉桂酸亲和力的唯一原因。
为进一步定位关键区域，研究人员构建了Ps4CL2和Ps4CL3之间的嵌合体酶，交换了它们的N端、SBR和C端区域。分析结果显示，SBR的交换主要再现了点突变的效果。更重要的是，含有Ps4CL2 N端的嵌合体（无论SBR和C端来源如何）对肉桂酸表现出更高的催化效率。这表明Ps4CL2的N端区域对于其高效利用肉桂酸至关重要，这一点与先前在拟南芥中的研究结论不同。C端区域的交换则对催化速率和亲和力有复杂影响，表明C端对催化活性有贡献。综合来看，Ps4CL2对肉桂酸的高效催化源于N端、SBR和C端多个区域之间复杂的相互作用，而非SBR中的单一或少数几个残基。
结论与研究意义
本研究成功鉴定并表征了欧洲赤松中一种对肉桂酸具有超高亲和力的4CL亚型——Ps4CL2。其与松木酚合成基因的共表达模式、高效的肉桂酸催化活性，以及独特的进化位置，共同确立了Ps4CL2是松木酚生物合成通路中催化肉桂酸激活步骤的最后一块拼图。该发现不仅解决了松木酚生物合成中长期悬而未决的关键酶学问题，深化了我们对松木天然防御机制的理解，也为通过分子育种改良松树木材抗腐品质提供了潜在靶点。此外，对Ps4CL2底物特异性分子基础的探索，揭示了4CL酶家族功能分化的复杂性，表明其底物偏好性是由整个酶分子的多个区域协同决定的，这为理解植物酶类的功能进化提供了新的视角。
