《Protein Science》：Post-translational regulation of human D-3-phosphoglycerate dehydrogenase in Alzheimer's disease
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本文聚焦于阿尔茨海默病（AD）中L-丝氨酸（L-Ser）代谢的性别差异，首次在人类海马体组织中发现并系统性研究了AD关键酶PHGDH的翻译后修饰（PTMs）谱。研究表明，PHGDH特定磷酸化位点（S55, T78）对其活性有开关式调控，而K289位点独特的去乙酰化仅见于AD男性患者，这些发现为阐明AD的性别特异性代谢脆弱性提供了新的分子机制，具有重要的病理学意义和潜在治疗靶点价值。
1 引言
记忆缺陷、认知障碍和运动功能障碍是阿尔茨海默病（AD）的特征，AD是全球最常见的痴呆症病因。新出现的证据表明，L-丝氨酸（L-Ser）代谢的性别特异性差异在AD中起着关键作用。尽管氨基酸平衡失调已被熟知，但最近的研究指出了丝氨酸生物合成途径的双态调控。为了探索这一点，研究人员检查了D-3-磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）——L-Ser从头合成的限速酶——的翻译后修饰（PTMs），作为这种差异的潜在机制。
在成年中枢神经系统中，磷酸化途径（PP）对于提供足够的L-Ser水平至关重要，否则由于氨基酸穿过血脑屏障的扩散能力极差，L-Ser水平将无法保证。该途径主要由三个酶协同作用：PHGDH、磷酸丝氨酸氨基转移酶（PSAT）和磷酸丝氨酸磷酸酶（PSP）。该途径一旦发生改变——无论是因葡萄糖摄入受损而减慢，还是可能因淀粉样蛋白β斑块诱导而上调——都会产生不足或异常水平的D-丝氨酸（D-Ser），这可能有助于AD相关的N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）功能障碍。因此，阐明调节PP的机制，特别是那些影响PHGDH活性的机制，可能揭示AD性别依赖性脆弱性的分子基础。
迄今为止，关于控制L-Ser生物合成的调控机制的实验证据仍然很少。除了PP和糖酵解之间的双向控制外，越来越多的研究已经确定翻译后修饰（PTMs），主要在癌细胞和组织中，是PHGDH活性、稳定性和区室化的关键调节因子。了解类似的调控机制是否发生在生理或神经退行性变环境中，对于定义PHGDH调节的更广泛意义至关重要。因此，本研究旨在通过质谱分析鉴定AD患者和健康个体（男性和女性）海马组织中的PHGDH PTMs，并表征模拟检测到的PTMs的蛋白质变体，以评估它们如何影响酶的生化、细胞特性以及通过PP合成L-Ser的速率。
2 结果
2.1 从人海马体中免疫沉淀PHGDH
为了鉴定健康人和AD患者人脑中的PHGDH PTMs，使用抗PHGDH抗体通过免疫沉淀（IP）分离蛋白质，并进行非靶向和靶向MS/MS分析。由于人源样品中内源性PHGDH含量较低，IP是一个具有挑战性的问题。因此，通过评估不同数量的样品、不同的商业多克隆抗体以及在组织裂解液中添加固定量的重组PHGDH作为阳性对照来优化IP策略。使用优化的基于抗体（Ab）：抗原（Ag）摩尔比~3:1的PHGDH-IP方案，从健康个体和AD患者的海马样品中回收了足够量的蛋白质用于后续分析。蛋白质印迹分析显示，蛋白质主要在SB1X洗脱的馏分中检测到，而在甘氨酸洗脱的馏分中几乎检测不到，表明PHGDH在免疫复合物内具有强而稳定的关联。IP前（PRE-IP样品）和IP后（POST-IP样品）裂解物中对应于PHGDH的信号的密度测定评估表明，平均IP产率约为65%，相当于从250μg总蛋白质开始，理论最大回收率约为100ng PHGDH。
2.2 通过MS/MS分析免疫沉淀的PHGDH鉴定PTMs
对来自女性和男性健康及AD患者（健康女性CTRF；健康男性CTRM；AD女性ADF；AD男性ADM）海马样品的IP富集后分离的PHGDH进行了nLC-MS/MS分析，以鉴定PTMs。由于可用样品量有限，分析集中在两种PTM上：磷酸化和乙酰化。每个样品首先通过非靶向MS/MS方法进行鉴定，然后进行靶向分析以确认结果。
MS/MS分析鉴定出五个在所有数据集中均被磷酸化的残基（S55、T60、T78、S383和S473）。值得注意的是，在已修饰的残基中，S383以前从未被描述为磷酸化。迄今为止，关于PHGDH PTMs的实验证据主要来自对肿瘤组织或细胞系的研究，在这些研究中，已知PHGDH在癌症进展中发挥着重要作用。相比之下，我们的分析提供了该蛋白在人类大脑（健康和AD患者）中PTMs的首次表征。由于所有组中都存在磷酸化，这削弱了磷酸化作为与AD或性别相关的PHGDH选择性调控机制的假设。由于可用的人类材料非常有限，无法进行额外的质谱分析，以提供有关每个磷酸化残基的修饰程度和位点占有率的信息。
此外，靶向MS/MS分析鉴定出K289残基在所有样品（AD男性患者除外）中均被乙酰化。
2.3 PHGDH变体的重组表达和纯化
为了评估PHGDH中已识别位点的磷酸化和乙酰化的影响，产生了携带天冬氨酸（模拟磷酸化）或谷氨酰胺（模拟乙酰化）的重组变体，以及相应的携带中性丙氨酸（用于磷酸化的丙氨酸扫描）或精氨酸（用于正电荷保留，用于赖氨酸乙酰化）的变体。所有PHGDH变体均以纯度>90%进行纯化。最高表达水平为T60D（~22 mg/L）、T78A（~24 mg/L）、S55A（~15 mg/L），以及T60A和S55D（~6 mg/L）。值得注意的是，C端区域383和473位的丙氨酸取代产生了易于在4°C聚集的变体蛋白；因此，解冻后这些蛋白质在后续生化表征过程中保持在室温下。这表明S383和S473残基可能对整体蛋白质稳定性有作用。
2.4 PHGDH变体的结构特性和稳定性
通过尺寸排阻色谱（SEC）评估了PHGDH变体在一系列蛋白质浓度（0.33、1、3.33和10 mg/mL）下的寡聚状态，并与野生型酶进行了比较。在10 mg/mL时，N端区域内的取代并未显著影响四聚体形成，尽管存在左肩峰表明早期聚集，表明天然折叠部分不稳定。在分析的变体中，S55D取代产生了最明显的寡聚状态变化，产生了~40%的蛋白质以高分子量聚集体形式洗脱的宽峰。由于蛋白质在浓缩过程中沉淀，无法将SEC分析扩展到T60D变体的高浓度，进一步表明其溶解度降低。值得注意的是，C端区域的取代——无论是模拟磷酸化（Asp）还是电荷中性（Ala）——即使在低于10 mg/mL的浓度下也会导致聚集，强调了C端残基对PHGDH四聚体结构的长程稳定的关键贡献。在浓度<3.33 mg/mL时，383和473位的变体在很大程度上仍保持四聚体，尽管有可检测到的聚集（<20%），证实了聚集倾向增加。引人注目的是，在所有测试浓度下，S473D取代始终有利于聚集而不是天然寡聚（79%聚集体），表明亚基间堆积强烈不稳定。最后，PHGDH K289乙酰化模拟变体（K289Q和K289R）形成了四聚体，但在所有条件下也积累了大量的聚集体，进一步支持了该位点在结构稳定而非寡聚转换中的作用。
关于热稳定性，野生型蛋白质和PHGDH变体的熔解温度（Tm）略有不同：T60A变体观察到最显著的降低（ΔTm= -4.7°C），S55D PHGDH观察到最大增加（ΔTm= 3.0°C）。关于构象研究，所有变体的远紫外光谱都类似于野生型PHGDH的光谱，信号强度存在一些差异，我们认为是由于部分蛋白质沉淀引起的。二级结构元件的估计表明，与野生型PHGDH相比，所有变体的二级结构含量相似，但K289Q PHGDH变体除外。
总之，引入的取代在很大程度上并不影响PHGDH的构象，导致主要影响溶解度和同源四聚体状态稳定性的局部改变。
2.5 PHGDH变体的动力学参数
使用分光光度法标准偶联测定评估了PHGDH变体的动力学参数，在340 nm监测NADH的产生。对于所有PHGDH变体，活性对底物浓度的依赖性遵循米氏双曲线行为，没有证据表明存在S形行为。
C端调控域内383和473位的丝氨酸-丙氨酸取代对kcat没有显著影响。然而，将这些残基替换为天冬氨酸（S383D和S473D变体）导致kcat比野生型PHGDH分别增加了约28%和13%。实际上，S55D和T78D的kcat分别比野生型PHGDH低25倍和10倍：底物附近存在带负电荷的基团阻碍了酶的活性，很可能是由于静电排斥，这体现在KM值的增加上。此外，S55A和T78A的取代都导致了转换数的轻微下降。有趣的是，残基T60的取代，即使属于底物和辅因子结合域，也没有产生kcat值的显著改变。总体而言，所有变体的KM值均高于野生型PHGDH，这导致了较低的动力学效率：与PHGDH野生型相比，S55D和T78D变体的动力学效率分别显著降低了435倍和44倍。
通过基于孔雀绿试剂与PS水解成L-Ser过程中释放的正磷酸盐形成的绿色复合物定量的不连续测定，评估了重构的PP在生理方向上的活性。有趣的是，当PHGDH变体与PSAT和PSP偶联时，其活性趋势与单独记录的PHGDH变体动力学趋势相似。特别是，S55D和T78D取代导致非常低的磷酸盐产量（与野生型PHGDH相比<15%），这表明体外途径重组并未克服PHGDH活性的降低，而PHGDH是PP中的限速步骤。有趣的是，包含野生型PHGDH（0.41 μM）与S55D或T78D变体（0.41 μM）等摩尔混合物的重构PP显示出与用0.41 μM野生型PHGDH单独组装的复合物相似的磷酸盐生产水平。这表明低活性变体不会损害野生型酶的催化能力，并且对包含野生型PHGDH的重构PP没有不利影响。值得注意的是，与野生型PHGDH相比，S383D、S473D和K289Q变体在600秒反应时间内显示出更快的磷酸盐生产（分别为64%、44%和45%），这一结果与它们较高的kcat值吻合良好。
苹果酸是PHGDH的替代底物，已被提出在酶磷酸化于S55和S371后的核转位后支持核NADH产生。在我们的测定条件下，S55D变体和野生型PHGDH对D，L-苹果酸（20 mM）的催化活性相当（0.005–0.006 U/mg蛋白质），相当于野生型酶在3PG上最大活性的<1%，以及S55D变体在3PG上达到的最大活性的12.5%。
2.6 NAD+/NADH与PHGDH变体的结合
野生型PHGDH在280 nm激发后的荧光光谱在330 nm处显示一个峰。蛋白质荧光强度通过添加NAD+或NADH而淬灭，表明辅因子结合促进了构象改变。所有PHGDH变体在NAD+或NADH结合后显示的荧光强度变化均低于野生型PHGDH，表明芳香族残基的暴露程度不同。
野生型PHGDH以及乙酰化和磷酸化模拟变体对NADH的结合是一个双相过程，第一相的特征是低Kd（在0.3和1 μM之间），第二相显示出更高的Kd值（比第一相高约50倍），并且与荧光强度的最大变化（在60%到72%之间）相关。野生型PHGDH与NAD+的结合是一个单相过程，Kd为82 μM，与S55A、T60A、T60D、T78A、T78D、S473A、K289Q和K289R变体观察到的相似。与野生型PHGDH相比，S55A和T78A PHGDH变体的Kd值较低（分别为42和13 μM），而K289Q、K289R和S473A PHGDH变体的Kd值>120 μM。相反，S55D、S383A、S383D和S473D变体显示出双相结合过程，第一相的Kd非常低（在1到13 μM之间），第二相的Kd较高（在20到160 μM之间）。
总而言之，NAD+/NADH与PHGDH的结合仅受到引入的取代的轻微改变。
2.7 PHGDH变体的亚细胞定位
鉴于最近的发现表明，L-Ser生物合成途径的第一个酶可以通过importin ?KPNB1在营养胁迫下获得核作用，特别是p38激酶对残基S371磷酸化后，我们试图研究上述残基上新发现的PTMs是否可能同样促进PHGDH在非肿瘤细胞中的核转位。已提出两个核转位序列：NLSa，残基L6-K33；NLSb，V31-T60。使用在线可用工具进行的生物信息学分析未能在野生型PHGDH或其模拟磷酸化或乙酰化的变体中识别出任何经典的核定位序列（NLS）。有趣的是，PSORT II预测S55D和T60A变体的核定位略有增加。
为了深入了解PHGDH的亚细胞定位，研究人员瞬时转染了内源性表达PP酶的U251胶质母细胞瘤细胞，并用编码与C端FLAG表位融合的野生型酶或其变体的pcDNA3.1+/C-(K)-DYK-hPHGDH-1xFLAG质粒，并通过共聚焦显微镜观察转染后48小时固定细胞的免疫染色分布。免疫荧光分析显示，与野生型相比，变体的分布没有重大差异，所有形式都主要存在于细胞质中。值得注意的是，S371D PHGDH一致地在小的核周聚集体（可能是囊泡结构）中积累，这表明与核信号传导相关的反应，尽管在这些条件下和/或在这种细胞系统中不足以进入细胞核，并且观察到K289Q和K289R变体的水平较低。
成像后分析涉及量化细胞核和整个细胞内重组蛋白的荧光强度，然后通过假设球形几何形状并从ROI衍生半径计算体积来估计其三维分布。在628个细胞中，未观察到野生型PHGDH与变体之间在核定位方面的显著差异，这与生物信息学预测一致。唯一的例外是T60A变体，其核信号显示出适度但具有统计学意义的增加（平均核分数：野生型=6.9%，T60A=11.1%）。
考虑到异源蛋白质表达的变异性，并考虑到重组K289Q和K289R变体水平明显较低，研究人员在将核信号和总信号归一化到其各自的平均值后重复了分析。这种校正表明，T60A PHGDH核定位的明显增加很可能是其较高表达水平的假象。有趣的是，归一化表明，与野生型蛋白质相比，K289R和S371D PHGDH的核定位减少，尽管后者仅勉强未能达到统计学显著性。虽然K289R的功能意义值得进一步研究，但S371D PHGDH的核排除与其观察到的核周聚集一致。
为了研究K289的乙酰化是否影响PHGDH蛋白质稳定性，对异位表达野生型PHGDH、乙酰化模拟K289Q变体或不可乙酰化K289R变体的U251细胞进行了放线菌酮（CHX）追踪分析。结果显示，野生型和K289R变体都显示出缓慢的衰减动力学，在CHX处理30小时后保留了其初始蛋白质水平的~70%–75%，这与PHGDH是一种本质上长寿命且稳定的酶相一致。相比之下，K289Q变体在相同条件下没有表现出类似的丰度下降，这表明该位置的乙酰化模拟取代改变了PHGDH的转换动力学。用DMSO代替CHX处理的对照细胞在整个测定过程中保持恒定的蛋白质水平，证实了观察到的下降反映了蛋白质合成的抑制，而不是实验变异性。
3 讨论
“磷酸化途径”是成年大脑中L-Ser的主要来源，因为这种氨基酸——尽管可以从饮食摄入、甘氨酸的酶促转化以及蛋白质和磷脂降解中自由获得——穿过血脑屏障的扩散能力很差。重要的是，PP为谷氨酸能神经递质系统提供L-Ser，这是两种内源性共激动剂D-Ser和Gly的前体，它们精细地调节NMDARs的激活状态。PHGDH，PP的第一个酶，优先在星形胶质细胞中表达；然后，L-Ser要么通过丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的酶促作用转化为Gly，要么被释放并被神经元摄取，神经元表达丝氨酸消旋酶（SR），催化其外消旋化为D-Ser。因此，正如在Phgdh?/?纯合敲除小鼠中观察到的早期胚胎致死性所进一步证实的那样，这种短的细胞质途径对于保证大脑的正常功能至关重要。与这些发现一致，研究人员最近报告了AD患者海马体中PHGDH、PSAT（以及SR）水平升高导致的L-Ser生物合成改变。有趣的是，研究表明L-Ser和D-Ser代谢受到不同的影响（并且可能受到不同的调节），这取决于个体性别。此外，PP酶可能的代谢组织（“丝氨酸体”）的发现可能意味着依赖于该瞬时复合物活性和稳定性的PP的复杂调控策略。
在本研究中，来自AD和健康受试者死后海马组织裂解物的IP样品经过MS分析以鉴定PTMs，重点关注磷酸化和乙酰化。在这方面，许多研究已经报道了PHGDH中的PTMs，但仅在致癌背景下探索它们，即在肿瘤和癌细胞系中。在这种背景下，除了磷酸化，PHGDH还被报道可以乙酰化、甲基化、泛素化和（体外）亚硝基化。表1列出了已鉴定或预测为负责每个位置磷酸化的激酶列表。据报道，肿瘤抑制因子PKCζ对PHGDH的S55、T57和T78磷酸化会抑制酶活性，防止细胞获得必要的可塑性，以在缺乏葡萄糖的情况下适应其代谢以利用谷氨酰胺，而谷氨酰胺可以来源于PP。此外，在营养胁迫下，p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）磷酸化PHGDH的S371，导致其易位到细胞核，在那里AMPK对S55的磷酸化触发了被修饰的PHGDH将苹果酸非经典地氧化成草酰乙酸，同时消耗NAD+。NAD+水平的降低反过来抑制了转录因子c-Jun的活性，其活性与细胞生长抑制有关，从而维持肿瘤进展。另一方面，Wang及其同事发现，RING finger E3泛素连接酶（RNF5）对PHGDH的泛素化以及乙酰转移酶Tip60和去乙酰化酶SIRT2介导的K58的可逆葡萄糖依赖性乙酰化，通过影响其细胞稳定性来调节PP酶水平。葡萄糖剥夺降低了PHGDH乙酰化，促进了酶与RNF5的相互作用，从而导致其降解，最终导致L-Ser、D-Ser和Gly减少、活性氧增加和细胞生长抑制。在这里，MS分析未检测到四个组（即男性/女性，健康/AD）之间的任何不同磷酸化模式，这表明，这种PTM不太可能促进性别依赖性的AD发病和发展。由于可用材料非常有限，无法应用互补的定量MS方法，这些方法可以提供有关每个位置的位点占有率和磷酸化相对程度的信息。相反，在所有类别的受试者中都发现了PHGDH K289残基的乙酰化，AD男性患者除外。
本研究确定了人海马体中通常被磷酸化的PHGDH残基，至少在衰老过程中；其中，S383以前未被观察到——并且仅被微弱预测——会发生修饰。值得注意的是，所有已鉴定的残基（S55、T60、T78、S93和S473）在物种间高度保守，并且与病理性单核苷酸多态性（SNPs）无关。对磷酸化模拟PHGDH变体的研究表明，只有残基S55和T78（被PKCζ修饰的残基）的磷酸化强烈影响酶活性（从而影响整体PP介导的L-Ser合成）以及蛋白质溶解度。S55和T78靠近3PG；因此，磷酸化应该导致底物的静电排斥，从而影响动力学性质。最近使用AlphaFold结合分子动力学精修对PHGDH的全长四聚体结构进行了建模。在该模型中，四聚化主要由C端ACT域介导，关键界面残基包括R454、P475、L478、P479、L482、L492和Y495，它们参与成对的非共价相互作用网络。473位的取代预计会干扰该界面，可能改变局部堆积，并促进ACT域内聚集倾向区域在二聚体-二聚体接触表面的暴露或加强。这种结构重排可以解释S473D/A变体显著的聚集倾向。甚至S55D、S383A和K289Q/R在所有测试的蛋白质浓度下都倾向于聚集。先前关于磷酸化后结合能变化的计算分析表明，蛋白质-蛋白质相互作用通常不会因这种修饰而受到显著干扰。与此概念一致，在重构的磷酸化途径内进行L-Ser合成的动力学测定表明，没有任何磷酸化或乙酰化模拟PHGDH变体表现出受损的复合物形成。相反，观察到的L-Ser生产速率的变化直接归因于单个PHGDH变体催化特性的改变，从而证实了PHGDH在该代谢途径中的限速作用。
值得注意的是，磷酸化和乙酰化似乎都不影响辅因子结合，也不利于PHGDH的核定位（所有修饰的残基都不属于最近提出与DNA相互作用的110-160区域）。研究结果表明，S55的磷酸化不足以实现PHGDH的核定位，从而更好地解释了在肿瘤细胞中观察到的与S371磷酸化的相互联系。这种与先前发现的差异可能归因于除了简单的磷酸化模拟取代之外缺乏额外的刺激。关于先前报道的S55磷酸化PHGDH对苹果酸活性增加的情况，研究结果并未证实这种证据：S55D变体对苹果酸的活性低于野生型PHGDH，并且远低于其对生理底物3PG的活性。此外，这项研究强调了磷酸化模拟S55D变体在亚细胞靶向上与癌细胞相比的显著差异，可能反映了肿瘤发展过程中不同的生理水平和代谢组学改变（特别是需要在细胞核中维持高NADH水平）。
关于K289乙酰化——先前报道在肿瘤细胞中不存在的一种修饰——数据表明它改变了PHGDH的二级结构并促进聚集体形成，同时使3PG脱氢酶活性、L-Ser生产效率和NADH相互作用基本不受影响。与野生型蛋白质和不可乙酰化K289R变体相比，在K289Q变体中观察到的细胞稳定性增加支持了这样一种观点，即该位置的乙酰化对PHGDH转换具有稳定作用。未检测到核定位改变的迹象。
进行了相关性分析，以将SEC衍生的四聚体丰度与四个独立的生化参数——热稳定性（Tm）、催化效率（kcat/KM）、α-螺旋含量和总二级结构含量（α-螺旋+β-折叠）——在每个蛋白质浓度下相关联。所有统计分析均采用Spearman等级相关系数。值得注意的是，SEC分析揭示了PHGDH变体之间的两种不同的聚集行为。一部分变体在低蛋白质浓度下已经表现出显著的四聚体损失，表明四级组装存在内在缺陷。相比之下，其他变体在低浓度下保持相对稳定的四聚体组装，但表现出明显的、浓度依赖性的四聚体损失。在所有测试浓度中，基线四聚体丰度和浓度依赖性的四聚体损失与热稳定性、二级结构含量和催化效率仅显示出微弱的单调关联。关于酶转换，在0.33 mg/mL时观察到基线四聚体丰度与kcat之间存在显著的负相关；这种相关性在较高的蛋白质浓度下逐渐减弱，并且在10 mg/mL时不存在。这种趋势反映了几种催化受损变体保留其四级结构，特别是当取代将带电残基引入活性位点时。综上所述，PTM模拟取代影响四级组装和浓度依赖性的寡聚化，同时很大程度上保留了全局折叠稳定性。因此，强烈的催化损伤与聚集增加并不系统性相关，例如S55D和T78D变体，它们在底物3-PG附近引入了负电荷。
