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本研究针对胶质母细胞瘤（GBM）模型缺乏肿瘤-实质相互作用、难以模拟患者肿瘤微环境的问题，研究人员通过CRISPR技术诱导具有Nf1、Trp53和Pten突变的小鼠脑肿瘤，从中建立了AMG5等六种细胞系。发现AMG5细胞在颅内同系移植后，能再现亲代肿瘤的弥散边缘、新生血管化及间质亚型特征（Sox2和Olig2低表达），为研究具有间质特征的GBM提供了一个可重复且生理相关的新工具。
胶质母细胞瘤（Glioblastoma， GBM）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤，其标准治疗方案在过去二十年里几乎没有改变。患者的中位生存期仅约15个月，五年生存率低至约5%，预后极差。这种疾病的难治性，与其高度侵袭性的生长模式、肿瘤内部的异质性以及能够逃避免疫系统监视的“冷肿瘤”微环境密切相关。为了开发更有效的治疗方法，科学家们亟需能够精准模拟人类GBM复杂特征的临床前模型。然而，传统的GBM研究模型，如广泛使用的U87、U251等细胞系的二维培养或其在免疫缺陷小鼠中的异位移植，往往难以重现GBM的关键特征，例如肿瘤细胞向正常脑组织的弥散性浸润、微血管异常增生、肿瘤核心的坏死以及免疫抑制性微环境。特别是，许多移植模型缺乏肿瘤与周围脑实质的真实相互作用，肿瘤边界清晰，与患者体内观察到的浸润性生长模式相去甚远。这严重限制了这些模型在转化研究中的应用价值。因此，构建一种能够更真实地模拟GBM生物学行为，尤其是具有特定分子亚型（如侵袭性更强的间质亚型）特征的免疫健全小鼠模型，成为了领域内一个重要的研究方向。
为了应对这一挑战，由Justin V. Joseph、Martin K. Thomsen等人领导的研究团队在《Neuroscience》上发表了一项研究。他们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在免疫健全的C57BL/6小鼠体内特异性诱导了胶质瘤，并从中成功建立和表征了一个新的同系胶质母细胞瘤细胞系AMG5。该细胞系能在同系小鼠中稳定形成肿瘤，并惊人地再现了亲代肿瘤的多个关键特征，为研究间质亚型GBM提供了一个强有力的新工具。
研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：首先，利用携带靶向Nf1、Trp53和Pten基因的sgRNA及Cre重组酶的腺相关病毒（AAV），通过立体定位注射到表达Cas9的小鼠脑内，在星形胶质细胞中诱导基因突变，从而在体（in vivo）生成原发性胶质瘤。其次，从这些肿瘤中分离组织，通过酶消化和悬浮培养，建立了能够在体外形成肿瘤球（spheroids）的细胞系。最后，将这些细胞系同系移植（orthotopic grafting）到健康C57BL/6小鼠的脑内，通过磁共振成像（MRI）动态监测肿瘤进展，并利用组织学、免疫组织化学（IHC）、Western blot和基因测序等技术对肿瘤和细胞进行全面的分子与病理学表征。
CRISPR诱导胶质瘤生成
研究人员向转基因表达Cas9的小鼠脑内注射了携带不同sgRNA组合的AAV，成功诱导了胶质瘤。MRI扫描和后续的组织学分析（H&E染色）证实了肿瘤的形成，免疫组化显示肿瘤细胞表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP，星形胶质细胞标志物）和Cas9，证实了其细胞来源和CRISPR系统的成功激活。Ki67染色表明肿瘤细胞处于活跃增殖状态，而Sox2阳性则提示细胞可能发生了去分化。
建立小鼠胶质瘤细胞系
从六个诱导的肿瘤中，研究人员成功建立了细胞系，这些细胞在体外能形成肿瘤球。通过桑格测序和Western blot分析，他们确认了不同细胞系中靶基因（Trp53、Pten、Nf1）的突变状态。值得注意的是，AMG5细胞系存在Nf1的纯合缺失以及Trp53和Pten蛋白的丢失。基因表达分析显示，与AMG2细胞相比，AMG5细胞的Sox2和Olig2表达降低，这提示了其不同的分子亚型倾向。
胶质瘤细胞的颅内移植与肿瘤发展
将建立的六个细胞系同系移植到小鼠脑中后，只有AMG2和AMG5两个细胞系能够在移植后形成肿瘤，其中AMG5细胞在所有移植小鼠中都成功致瘤。MRI扫描显示，AMG5形成的肿瘤具有致密的核心和弥散、浸润性的边缘，甚至可跨中线播散，这与亲代肿瘤的侵袭表型相似。而AMG2形成的肿瘤则更为致密，边界相对清晰。
组织学表型分析
对AMG2和AMG5移植瘤的详细组织学评估进一步揭示了差异。Cas9染色清晰显示，AMG5肿瘤除了致密核心外，还具有由松散排列细胞构成的弥散性浸润边缘，并且存在新生血管。Ki67染色证实两者均为增殖性肿瘤。关键的是，AMG2肿瘤中Sox2表达较高，而AMG5肿瘤中Sox2表达显著降低。两种肿瘤中都存在F4/80阳性的巨噬细胞，且均表达GFAP。
免疫特征分析
免疫微环境分析发现，虽然CD4+和CD8+T细胞在两种肿瘤中均有浸润，但主要集中于肿瘤边界。与AMG5肿瘤相比，AMG2肿瘤中的T细胞浸润更多。总体而言，特别是AMG5肿瘤，其免疫细胞浸润水平较低，可被视为非免疫原性或“免疫冷”肿瘤。
本研究成功建立并鉴定了一个新型的同系胶质母细胞瘤小鼠模型AMG5。该模型的核心结论和重要意义在于：首先，AMG5细胞系源于CRISPR诱导的、携带Nf1、Trp53和Pten突变的小鼠胶质瘤，其同系移植后形成的肿瘤高度模拟了亲代肿瘤的关键病理特征，特别是再现了人类GBM间质亚型中常见的弥散性、浸润性生长边缘和新生血管化，克服了传统移植模型肿瘤边界清晰、缺乏浸润的局限性。其次，该模型表现出间质亚型GBM的分子特征，即Sox2和Olig2表达降低，同时肿瘤微环境中含有巨噬细胞但总体T细胞浸润水平较低，模拟了临床上的“免疫冷”肿瘤状态。这使其成为研究GBM侵袭生物学和免疫治疗耐受机制的理想平台。
讨论部分强调，拥有准确可靠的胶质瘤模型对于推动该疾病的理解和治疗至关重要。AMG5模型不仅生长模式更生理相关（约6-8周达到终点，适合干预研究），而且由于其同系和可移植的特性，便于进行遗传操作和重复实验，大大提高了临床前研究的效率和可控性。该模型为测试新的治疗策略，尤其是针对侵袭性间质亚型或旨在将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”的免疫疗法，提供了一个极具价值的工具。总之，AMG5细胞系填补了现有GBM模型体系的空白，通过提供一个具有重现性、生理相关性且具备特定分子亚型特征的体内研究系统，有望加速胶质母细胞瘤新疗法的开发进程。
