巴基斯坦拉瓦尔品第地区健康肉鸡抗生素耐药菌的表征及大肠杆菌菌株的系统发育分析

《One Health》：Characterization of antibiotic-resistant bacteria and phylogenetic analysis of E. coli strains isolated from healthy broilers in Rawalpindi, Pakistan

本文针对家禽养殖中抗生素滥用导致耐药菌滋生并威胁公共健康的现状，研究团队在巴基斯坦拉瓦尔品第地区，从健康肉鸡泄殖腔拭子中分离并表征了对头孢噻肟(cefotaxime)、美罗培南(meropenem)、环丙沙星(ciprofloxacin)和粘菌素(colistin)等多种重要抗生素具有耐药性的细菌，并重点分析了大肠杆菌(E. coli) 菌株的耐药基因携带情况及系统发育分组。研究发现，分离株中大肠杆菌占比最高（66.7%），且普遍携带多种耐药基因，特别是粘菌素耐药基因mcr-1检出率高达77.7%。此外，研究还鉴定出多种与病原性相关的大肠杆菌系统发育群。这项研究揭示了健康家禽作为抗生素耐药菌及耐药基因储存库的严重性，为制定“同一健康(One Health)”框架下的抗菌药物管理策略提供了关键数据。

　　

在现代集约化家禽养殖中，抗生素被广泛用于预防疾病、促进生长，但这把“双刃剑”也催生了一个严峻的全球性公共卫生问题：抗生素耐药性(AMR)的加速出现与传播。动物体内产生的耐药细菌及其携带的耐药基因，可以通过食物链、环境接触等途径转移给人类，使得一些原本可治的感染变得棘手甚至无药可医。巴基斯坦是全球重要的家禽生产与消费国，其行业对抗生素的依赖程度高，监管面临挑战，这使得评估该国禽类中的耐药菌流行情况变得至关重要。为此，一项发表在《One Health》期刊上的研究，将目光投向了巴基斯坦拉瓦尔品第地区的健康肉鸡，旨在摸清这些看似健康的禽类体内，究竟潜伏着多少“耐药战士”，以及它们具备哪些“武器装备”（耐药基因）。

为了回答上述问题，研究人员于2020年12月至2021年3月期间，从拉瓦尔品第地区的家禽养殖场和零售店采集了151份肉鸡泄殖腔拭子样本。他们采用了多种关键实验技术来开展研究：首先，使用添加了特定抗生素（头孢噻肟、美罗培南、环丙沙星、粘菌素）的选择性培养基，从样本中筛选和分离耐药细菌。其次，对从非抗生素培养基上分离的部分大肠杆菌(E. coli) 和铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) 菌株，按照临床和实验室标准协会(CLSI)2025年指南进行了抗生素敏感性试验，评估其对18种不同类别抗生素的耐药表型。再者，运用了多种分子生物学技术，包括单重及多重聚合酶链式反应(PCR)，来检测与β-内酰胺类、碳青霉烯类、喹诺酮类和粘菌素耐药相关的关键基因，如bla_TEM、bla_CTX-M、bla_SHV、bla_OXA-48、qnr基因以及mcr-1基因。此外，研究还采用了基于Clermont法的多重PCR对大肠杆菌分离株进行了系统发育分群，以了解其种群结构和潜在致病性。最后，通过肠杆菌基因间重复共有序列(ERIC) PCR分析了菌株间的遗传相关性。

研究结果揭示了以下关键发现：

细菌分离与流行情况：从151份样本中共分离到1505株细菌，其中大肠杆菌(E. coli) 是最主要的菌种，占66.7%（1008/1505），其次是铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) （15.48%）和金黄色葡萄球菌(S. aureus) （14.35%）。

抗生素选择性平板上的耐药菌分布：在不同抗生素选择性平板上，大肠杆菌和铜绿假单胞菌对四种测试抗生素均有耐药菌株生长。例如，在头孢噻肟平板上，31.05%的大肠杆菌分离株（313株）和37.76%的铜绿假单胞菌分离株（88株）能够生长。

代表性菌株的抗生素敏感性：对非抗生素平板上分离的少量大肠杆菌（22株）和铜绿假单胞菌（24株）进行标准药敏试验发现，大肠杆菌对氨苄西林、哌拉西林-他唑巴坦、头孢他啶、头孢他啶-阿维巴坦、头孢噻肟、氨曲南和环丙沙星的耐药率均达到或超过50%。其中，36.36%的大肠杆菌和33.33%的铜绿假单胞菌被归类为广泛耐药(XDR)菌株。

耐药基因的检测：分子检测显示，在头孢噻肟耐药性大肠杆菌中，bla_TEM 基因（19.69%）和bla_CTX-M 基因（14.64%）最为常见。在美罗培南耐药性大肠杆菌中，检测到了碳青霉烯酶基因bla_OXA-48 （0.86%）。质粒介导的喹诺酮耐药(PMQR)基因qnrS（12.71%）的流行率高于qnrB（2.54%）。尤为值得注意的是，粘菌素耐药基因mcr-1在大肠杆菌中的检出率极高，达到77.7%（129/166）。类似地，在铜绿假单胞菌中也检出了bla_TEM、bla_SHV 和bla_CTX-M 等β-内酰胺酶基因，以及少量的bla_OXA-48 和mcr-1基因。

大肠杆菌的系统发育分析：对105株大肠杆菌进行系统发育分群显示，菌株分布在多个群组中。最常见的群组是E/Clade I（19.04%）和B1（18.09%），其中B1群通常与共生菌株相关，而E群则与肠出血性大肠杆菌(EHEC) 有关。只有一株菌（0.95%）属于与肠外致病性大肠杆菌(ExPEC) 相关的B2群。ERIC-PCR分析进一步表明，这些菌株具有高度的遗传多样性。

结论与讨论部分强调，这项研究具有重要的公共卫生意义。 研究表明，巴基斯坦拉瓦尔品第地区外观健康的肉鸡，其肠道内普遍存在着对头孢噻肟、美罗培南、环丙沙星和粘菌素等多种“关键重要抗生素”具有耐药性的细菌，尤其是大肠杆菌。高流行率的mcr-1基因（粘菌素耐药）以及多种超广谱β-内酰胺酶(ESBL)和碳青霉烯酶基因的检出，敲响了警钟。粘菌素被认为是治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的“最后手段”之一，其在动物中的滥用无疑加速了耐药性的传播，严重威胁人类临床治疗的有效性。

研究还发现，这些大肠杆菌菌株主要属于B1和E/Clade I等系统发育群，它们可能作为关键耐药基因（如mcr-1和bla_CTX-M）的储存库。尽管本研究存在一些局限性，例如未进行全基因组测序以全面揭示耐药基因组，且报告的是分离株水平而非样本水平的流行率，但所得数据清晰地表明，家禽养殖场是抗生素耐药细菌和基因的重要“孵化器”和“中转站”。

综上所述，该研究为巴基斯坦乃至全球的抗生素耐药性监测提供了宝贵的基线数据。它强有力地证明，为遏制抗生素耐药性的蔓延，必须采取“同一健康(One Health)”的综合策略，重新评估并严格限制在畜牧业，特别是家禽养殖中，滥用包括粘菌素在内的关键抗生素。同时，亟需将家禽的常规筛查纳入国家抗生素耐药性监测计划，并加强生物安全措施，以阻断耐药菌在动物、人类和环境之间的传播链条，保障公共卫生安全。