《Wound Repair and Regeneration》：Regulation of Embryonic Wound Healing by Matrix Metalloproteinases in Xenopus laevis Tailbud Stage
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本文推荐：本研究深入揭示了胚胎无疤痕愈合的关键机制，聚焦于中间期重塑基因——基质金属蛋白酶（MMPs）在非洲爪蟾（Xenopus laevis）模型中的作用。研究发现，早期应激反应激活AP-1，进而驱动四种核心MMPs（mmp1.S, mmp7.L, mmp8.L, mmp9.S）的表达，这些酶对于伤口闭合、细胞迁移和细胞外基质（ECM）重塑至关重要。通过抑制剂和基因敲降实验，证实了MMPs功能缺失会导致肌动蛋白环形成缺陷和基底膜修复障碍。研究还通过整合单细胞和批量RNA测序数据，证明了该调控通路在哺乳动物伤口愈合中的保守性，为理解再生医学中的无疤痕愈合机制提供了重要见解。
引言
伤口愈合及其调控是医学和生物学研究的重要领域，具有改善治疗方法的巨大潜力。愈合被定义为皮肤完整性和稳态恢复的过程。成年伤口愈合通常以疤痕形成为终点，而胚胎伤口愈合则更快且无疤痕，但其背后的信号分子和调控机制仍所知有限。在非洲爪蟾胚胎中，愈合过程分为早期、中期和晚期三个阶段。本研究聚焦于中期阶段，探究被称为基质金属蛋白酶（MMPs）的重塑基因的作用。MMPs是一类在成年伤口愈合中功能明确但在胚胎中作用尚不清楚的酶。我们的研究旨在揭示MMPs及其上游调控因子AP-1在非洲爪蟾胚胎伤口愈合中的具体作用。
材料与方法
研究使用非洲爪蟾胚胎作为模型。通过显微操作在胚胎侧边制造110–130 μm的划痕伤口。为了探究MMPs的功能，使用了四种化学抑制剂：D609（广谱MMP抑制剂）、MMP-8特异性抑制剂（MMP-8 Inhibitor I）、广谱抑制剂GM6001（靶向MMP 1, 2, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 16, 26）和Batimastat（主要抑制MMP 1, 2, 7, 9）。此外，还设计了针对AP-1基因fos和jun不同亚型（L/S）的吗啉寡核苷酸（MO）进行基因敲降实验。通过免疫荧光染色观察肌动蛋白（Actin）环和层粘连蛋白（Laminin）的重塑，通过RT-qPCR和整体RNA测序分析基因表达变化，并通过原位杂交确定mmp基因的表达细胞类型。研究还重新分析了已发表的小鼠和人类伤口愈合微阵列及单细胞RNA测序数据集，以进行跨物种比较。
结果
3.1 愈合中期MMPs的高表达
对非洲爪蟾胚胎伤口愈合的批量RNA测序数据分析显示，许多mmp基因在被称为中期的阶段表达。在伤口部位，mmp1.S、mmp7.L和mmp8.L在伤后约3小时达到表达峰值，而mmp9.S在伤后6小时达到最高表达。RT-qPCR结果验证了这些表达谱。进一步的RT-qPCR分析显示，mmp1和mmp8在整个胚胎中表达上调，而mmp7和mmp9的表达水平保持稳定。单细胞RNA测序数据分析表明，mmp1.S和mmp8.L在伤口相关的表皮细胞中局部表达，而mmp7.L和mmp9.S主要在迁移性的髓系细胞中表达。
3.2 MMPs是胚胎伤口愈合所必需的
MMPs表达在伤后3–6小时达到峰值，提示它们在愈合中晚期的重要性。使用广谱MMP抑制剂D609或MMP8特异性抑制剂（mmp8i）进行瞬时抑制实验，发现两者均导致伤口闭合能力减弱。对照胚胎在3小时内闭合了97.3%的伤口，而D609处理组和mmp8i处理组分别仅闭合了18.8%和68.6%。RT-qPCR和原位杂交结果显示，抑制剂处理降低了伤口区域其他mmp的表达。免疫荧光染色显示，抑制剂处理导致肌动蛋白-肌球蛋白环形成不良，并且层粘连蛋白层的重塑失败，表明MMPs对于伤口收缩和细胞外基质（ECM）重塑至关重要。另外两种广谱抑制剂GM6001和Batimastat也显示出类似的伤口闭合抑制效果。
3.3 AP-1是MMPs表达所必需的
早期基因表达波（伤后约1小时）包括代谢变化和应激反应基因，其中AP-1组分（如jun和fos）高度表达。为了探究AP-1与mmp表达之间的关联，研究使用了针对fos和jun的吗啉寡核苷酸（MO）。单独注射fos或junMO导致伤口闭合率分别降至70%和72.3%，而将fos:junMO以3:1比例组合注射时，闭合率大幅下降至25.6%。RT-qPCR分析显示，AP-1功能缺失胚胎中mmp1.S、mmp8.L和mmp9.S的表达显著降低，而mmp7.L的表达无显著变化。原位杂交结果进一步证实了mmp1和mmp8在伤口部位染色的减少，以及使用mmp7和mmp9染色显示的髓系细胞迁移缺陷。AP-1功能缺失胚胎同样表现出肌动蛋白环形成和层粘连蛋白层形成的缺陷。
3.4 Mmp基因的表达在不同模型间显示出相似性
为了研究非洲爪蟾模型与哺乳动物伤口愈合数据集之间调控机制的保守性，研究分析了可用的小鼠和人类微阵列研究数据。AP-1基因（fos和jun）的表达在愈合早期阶段表现出相似的快速增加，随后在后期阶段下降。在mmp基因方面，它们在愈合中期（伤后3小时至1天之间）表达达到峰值，随后在后期阶段表达下降，在所有研究的组织和模型中均观察到这一模式。
3.5 Mmp和AP-1基因的表达在细胞水平也显示出相似性
在单细胞水平比较了非洲爪蟾与哺乳动物愈合模型中感兴趣基因的表达。在非洲爪蟾中，mmp1.S和mmp8.L在表皮细胞亚群和脊索细胞中表达，而mmp7.L和mmp9.S在髓系细胞中表达。fos和jun基因则表现出更广泛的表达。人类单细胞分析显示，fos和jun广泛表达，而Mmps则呈现细胞特异性表达（Mmp1在皮肤角质形成细胞中；Mmp7和Mmp9在髓系细胞中）。小鼠单细胞分析再次显示fos/jun在许多细胞类型中表达，而Mmps则特异性表达（Mmp13和Mmp7在成纤维细胞中；Mmp8和Mmp9分别在髓系和树突状细胞中占主导）。对非洲爪蟾单细胞数据的时间平均表达分析证实，mmp1和mmp8在伤后表达增加，而mmp7和mmp9的表达在1小时和3小时保持稳定，在12小时可能因髓系细胞迁移至伤口区域而有所增加。
讨论
胚胎伤口愈合是一个复杂的过程，涉及周围细胞的表型变化和广泛的基因表达活动。可以观察到几波新的基因表达，第一波早期波发生在伤后30至60分钟，以应激反应基因为特征，包括AP-1通路。这些早期反应基因对于细胞迁移和再上皮化至关重要，并有助于促进具有AP-1结合位点的其他基因（如角蛋白和基质金属蛋白酶）的表达。第二波基因表达发生在伤后3至6小时，其特征是防御反应、细胞过程（如增殖或细胞死亡）的激活以及ECM的重塑。MMPs可能是非洲爪蟾胚胎中ECM重塑的关键酶。
基于我们的批量RNA-Seq数据，至少有15个mmp基因参与伤口愈合。我们选择了四个最显著的mmps：mmp1、mmp7、mmp8和mmp9进行进一步分析。我们在伤口部位观察到这些mmps在伤后约3小时表达增加。同样，在小鼠和人类愈合数据集中，这些mmps在损伤后也在伤口部位显示出表达增加。在非洲爪蟾胚胎中，mmp7和mmp9在迁移至伤口区域的髓系细胞中表达。与髓系细胞迁移和mmp7、mmp9在损伤后积累相反，我们发现mmp1和mmp8在伤口周围的上皮细胞中表达。我们还观察到mmp基因负责闭合伤口和重塑层粘连蛋白层。
这些mmps在损伤后表达的跨物种保守性可能源于它们的功能作用。在哺乳动物中，Mmp1已被证明可以加速上皮化、减少炎症和增加血管生成，同时减少疤痕形成。Mmp8在其他愈合模型中也有强烈增加的记录，并被认为有助于炎症反应。在哺乳动物中，Mmp7参与再上皮化，它切割ECM或ECM相关蛋白并促进角质形成细胞迁移。Mmp9在哺乳动物伤口愈合中对胶原重组和角质形成细胞迁移至关重要。最近的哺乳动物单细胞研究也显示了愈合过程中mmps表达的差异。
总而言之，我们的研究表明AP-1和mmps表达的组合及依赖性对于胚胎伤口愈合至关重要。mmps表达的中断导致髓系细胞功能不全，这些细胞无法迁移至伤口区域，并阻止边缘上皮细胞中肌动蛋白-肌球蛋白环的形成，最终导致伤口闭合缺陷。
结论
我们首次提供了非洲爪蟾胚胎伤口愈合中特定mmp基因（mmp1.S、mmp7.L、mmp8.L和mmp9.S）的详细时间分析，展示了它们的重要性。我们还证明了mmp基因在功能上依赖于早期的AP-1激活通路。这些结果支持早期应激反应与ECM重塑酶之间的直接联系。我们对批量RNA-seq和单细胞RNA-seq数据的整合分析证实，在非洲爪蟾中观察到的mmps表达模式在细胞水平上也保守于哺乳动物伤口愈合中。这显示了其在治疗靶向方面的潜力。
