《Pathology - Research and Practice》：RhoB-Rab1A forms a mechanobiology module that couples cytoskeletal organization to nuclear mechanics and β-catenin access in epithelial cells
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通过结直肠上皮细胞模型，研究发现RhoB与Rab1A模块连接细胞骨架力学与β-catenin核定位，调控上皮间质化（EMT）程序。敲除RhoB导致F-actin聚合减少、应力纤维和伪足形成受损，细胞及核刚性增加，核β-catenin水平下降并伴随上皮标志物升高，抑制迁移、侵袭和肺转移。共沉淀和质谱分析表明Rab1A是RhoB的相互作用者，双重干扰增强效应。该机制揭示机械信号通过RhoB-Rab1A复合物调控β-catenin核可及性，为机械 informed控制上皮行为提供理论依据。
李英琪|王子伟|于金民|梁希茹|程玉同|马娟|彭玉欣|王金海|刘娜|李璐|赵伟|史海涛|谢宁
西安交通大学第二附属医院消化内科，中国陕西省西安市710049
摘要
上皮细胞的转移能力源于细胞骨架力学与核转录调控的耦合。在本研究中，我们利用结直肠上皮细胞模型，定义了一个RhoB–Rab1A模块，该模块将肌动蛋白的组织结构与β-连环蛋白的核内运输联系起来，从而调节上皮-间质转化（EMT）过程。通过对RhoB活性细胞和RhoB缺陷细胞的转录组及核蛋白组进行分析，发现EMT和Wnt/β-连环蛋白通路相关基因的表达显著增强。RhoB的缺失导致F-肌动蛋白聚合减少、应力纤维和伪足形成减弱，细胞及核的硬度增加（通过原子力显微镜检测），核内β-连环蛋白水平下降，并伴有上皮细胞特性的出现。共免疫沉淀/质谱分析和成像技术证实Rab1A是RhoB的相互作用蛋白；同时干扰RhoB和Rab1A的表达可进一步增强这些效应，包括力学特性、β-连环蛋白的分布、EMT相关标志物的表达以及细胞的迁移和侵袭能力。这些数据支持了一种从力学机制到核内信号传导的途径，即Rho GTP酶通过与Rab GTP酶的相互作用，在没有外源性Wnt信号的情况下调节β-连环蛋白的活性。我们提出RhoB–Rab1A复合体作为一个分子开关，调控上皮细胞的可塑性，这为基于力学原理控制上皮细胞行为提供了通用机制。
引言
转移是上皮癌预后的关键决定因素[1]。除了经典的生化信号通路外，越来越多的证据表明，细胞和核的力学特性能够调节转录因子的活性，进而影响上皮细胞的可塑性和侵袭性[2],[3],[4]。小GTP酶通过整合细胞突起的动态、应力纤维的收缩以及黏附过程，协调肌动蛋白的排列、牵引力的产生和极性，从而实现定向迁移[5],[6]。在Rho家族中，RhoB在调控细胞骨架重塑和力传导方面起着重要作用[7]；然而，RhoB是否直接调控肌动蛋白的组织结构并影响与转移相关的核内信号通路，以及其在力学-核信号通路中的具体作用机制尚不明确。
因此，我们选用结直肠上皮细胞系作为易于研究表型和测量的模型系统，比较了RhoB活性细胞和RhoB缺陷细胞之间的转录组差异。分析结果显示，根据RhoB的状态，上皮-间质转化（EMT）和Wnt/β-连环蛋白通路相关基因的表达存在显著差异。EMT是上皮细胞转移能力的关键过程[8],[9]，它涉及上皮细胞特性的丧失（如顶基底极性和E-钙粘蛋白介导的细胞连接），同时获得增强迁移和侵袭性的间质细胞特性[8]。这些变化伴随着细胞骨架的重塑和细胞硬度的降低，从而有利于肿瘤对周围组织的侵袭[10],[11]。这些结果表明，小GTP酶调控的细胞骨架和生物力学状态可能是EMT可塑性的关键调节因素[6]。尽管先前的研究已经将RhoB与转移和耐药性联系起来[12],[13]，但RhoB如何通过调控细胞骨架与核内的力学耦合来影响EMT过程仍需进一步研究。
为了解决这一科学问题，我们在该上皮细胞模型中结合了基因干扰、定量细胞骨架和纳米力学测量、亚细胞定位分析以及迁移和侵袭实验（见图1a）。研究结果表明，RhoB的缺失导致F-肌动蛋白聚合减少、应力纤维和伪足形成减弱，细胞及核的硬度增加，核内β-连环蛋白水平下降，并伴有上皮细胞向间质细胞表型的转变，同时迁移能力减弱。我们还发现Rab1A是RhoB的相互作用蛋白，两者共同作用时效果更为显著。这些发现揭示了一种从力学机制到核内信号传导的途径，即RhoB和Rab1A组成的复合体通过调控细胞骨架的组织结构来影响β-连环蛋白的核内分布和EMT相关特性，为基于力学原理控制上皮细胞行为提供了理论依据。
细胞培养和试剂
人结直肠癌细胞系SW480和DLD-1购自美国典型培养 kolektion (ATCC，马里兰州马纳萨斯)。RhoB敲除细胞系是使用预先设计的人类RhoB CRISPR敲除试剂盒（编号KN209837，OriGene，马里兰州罗克维尔）生成的。细胞在含有10%胎牛血清（Gibco）和1%青霉素-链霉素（10,000 U/mL，Gibco）的DMEM培养基中培养，培养条件为37°C、5%二氧化碳的湿润培养箱。
慢病毒制备和细胞转染
为了实现RhoB的稳定敲低
RhoB的缺失抑制了CRC细胞的迁移、侵袭和实验性转移
为了验证RhoB是否调控转移行为，我们构建了RhoB敲除的SW480细胞系（KO55；见图S1a），并通过siRNA技术在DLD-1细胞中沉默RhoB（见图S1b）。选择SW480是因为其具有间质细胞样的表型，并已广泛应用于EMT/力学传导研究；DLD-1是一种 MSI（微卫星不稳定）模型，可作为上皮细胞类型的对照。这两种细胞系都适合进行基因操作和活细胞纳米力学测量。在Transwell实验中...
讨论
本研究发现了一个由小GTP酶RhoB及其相互作用蛋白Rab1A组成的模块，该模块将细胞骨架的组织结构与核内力学特性联系起来，进而调节上皮细胞中β-连环蛋白的核内运输。RhoB和Rab1A通过协同作用，调控肌动蛋白的动态变化和β-连环蛋白的核内转运，从而影响EMT相关过程。通过这种机制，RhoB和Rab这两个GTP酶家族共同参与了细胞行为的调控。
CRediT作者贡献声明
李璐：监督工作。
刘娜：监督工作。
王金海：概念设计。
彭玉欣：方法学研究。
马娟：数据可视化。
程玉同：软件开发。
梁希茹：软件开发。
于金民：数据管理。
谢宁：撰写、审稿与编辑；初稿撰写。
王子伟：软件开发、方法学研究、实验设计。
史海涛：监督工作。
李英琪：初稿撰写、方法学研究、数据管理。
赵伟：监督工作。
伦理批准
本研究已获得西安交通大学医学院伦理委员会的批准（批准编号：2018–226）。
资助
我们的研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82303812和82560549）的支持。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
我们的研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82303812和82560549）的支持。
