《Phytomedicine》：Kakkalide promotes spinal cord injury repair by regulating microglial M2 polarization via mitophagy
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脊髓损伤（SCI）后持续的次级炎症会阻碍神经功能恢复，而调控免疫核心细胞——小胶质细胞的极化是关键。本研究聚焦于天然异黄酮Kakkalide，探究其是否能够通过调节SIRT3（线粒体去乙酰化酶）依赖的BNIP3/NIX介导的线粒体自噬，改善线粒体稳态，从而驱动小胶质细胞由促炎的M1表型向抗炎的M2表型转化，最终促进脊髓损伤后功能恢复。
脊髓是人体信息传递的高速公路，一旦因外伤发生脊髓损伤（SCI），不仅会导致瘫痪等严重后果，其后续引发的“次级损伤”更是一个难以治愈的医学难题。这场由免疫细胞主导的“炎症风暴”，特别是大脑和脊髓中的“常驻免疫警察”——小胶质细胞的过度活化，会持续释放有害物质，加重神经损伤，阻碍修复。目前，临床上有效抑制这种神经炎症的药物非常有限，这使得寻找能够精准调控免疫、促进神经修复的新型治疗策略变得尤为迫切。
正是在这一背景下，来自葛花的一种天然活性成分——Kakkalide（鹰嘴豆芽素A-7-O-木糖葡萄糖苷）走入了研究人员的视野。它在肠炎、肝损伤等模型中已展现出强大的抗炎和抗氧化能力，但其能否成为脊髓损伤的“救星”，背后的作用机制又是什么，此前尚属未知。为此，研究人员在《Phytomedicine》上发表了一项研究，系统揭示了Kakkalide通过一个名为SIRT3的“线粒体开关”，启动“细胞清洁工”——线粒体自噬，从而“净化”小胶质细胞内部环境，促使其由“破坏者”（M1型）转变为“修复者”（M2型），最终助力脊髓功能恢复的全新机制。
为阐明这一机制，研究人员综合运用了多层面技术方法。在动物层面，他们建立了小鼠脊髓挫伤模型，通过腹腔注射Kakkalide进行干预，并利用Basso小鼠量表（BMS）、足迹分析、转棒实验和残余尿量测量系统评估了运动与膀胱功能的恢复情况。在细胞与分子层面，研究使用脂多糖（LPS）刺激的BV2小胶质细胞系构建体外炎症模型，通过蛋白质组学分析和分子对接技术预测了Kakkalide的潜在作用靶点，并利用SIRT3特异性抑制剂3-TYP、小干扰RNA（siRNA）敲低和过表达质粒等手段进行了功能验证。此外，研究还采用了包括蛋白质印迹（Western blotting）、实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、免疫荧光染色、酶联免疫吸附测定（ELISA）以及JC-1、MitoSOX Red等荧光探针，全面检测了炎症因子、细胞极化标志物、线粒体膜电位（ΔΨm）、活性氧（ROS）水平以及线粒体自噬相关蛋白的表达与定位。
研究结果揭示了以下关键发现：
1. Kakkalide抑制小鼠脊髓损伤后的次级炎症并促进功能恢复
通过动物实验证实，Kakkalide治疗能显著降低脊髓组织中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和环氧合酶-2（COX-2）等炎症因子的水平，缩小损伤病灶，并有效改善后肢运动功能、协调性及膀胱功能。
2. Kakkalide在体内外调控BV2小胶质细胞极化
在脊髓损伤小鼠体内和LPS刺激的BV2细胞中，Kakkalide处理均能降低M1型标志物（如iNOS、CD86）的表达，同时提升M2型标志物（如Arg-1、CD163）的表达，表明其能促进小胶质细胞从促炎M1表型向抗炎M2表型转变。
3. Kakkalide通过调节小胶质细胞极化而非直接作用来保护神经元
研究发现，Kakkalide对缺氧缺糖（OGD）损伤的PC12神经元细胞的直接保护作用微弱。然而，将经Kakkalide处理的活化小胶质细胞的条件培养基用于培养受损神经元后，却显著减少了神经元凋亡。这证明Kakkalide的神经保护作用主要是通过调控小胶质细胞的表型间接实现的。
4. 蛋白质组学提示Kakkalide的治疗作用与线粒体功能密切相关
对脊髓组织进行蛋白质组学分析发现，Kakkalide处理后差异表达的蛋白质主要富集于“氧化磷酸化”、“线粒体组织”等与线粒体结构和功能相关的通路，提示线粒体可能是其发挥作用的关键细胞器。
5. Kakkalide在活化的BV2小胶质细胞中维持线粒体完整性及功能
细胞实验表明，Kakkalide能逆转LPS引起的线粒体膜电位下降，减少细胞色素C（Cytochrome c）的胞浆释放，并显著抑制线粒体活性氧（mtROS）和总ROS的过量产生，有效维持了线粒体稳态。
6. Kakkalide诱导活化的BV2小胶质细胞发生BNIP3/NIX依赖的线粒体自噬
机制探索发现，Kakkalide能特异性上调线粒体自噬受体BNIP3和NIX（亦称BNIP3L）的mRNA和蛋白水平，但对PINK1/PARKIN通路影响不大。同时，它增加了自噬标志物微管相关蛋白轻链3-II（LC3-II）并降低了底物P62的积累，表明其激活了BNIP3/NIX依赖的线粒体自噬途径。
7. Kakkalide通过激活线粒体自噬来调节BV2小胶质细胞极化
使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1和激活剂尿石素A（Urolithin A, UA）进行验证，发现抑制自噬会削弱Kakkalide促M2极化的效果，而激活自噬则能增强该效果，证实线粒体自噬是Kakkalide调控小胶质细胞表型转换的关键环节。
8. SIRT3被确认为Kakkalide调控线粒体自噬的潜在靶点
通过生物信息学分析（包括差异蛋白筛选、LASSO回归）结合分子对接与分子动力学模拟，研究人员预测并验证了线粒体去乙酰化酶SIRT3是Kakkalide的潜在直接作用靶点，两者具有高亲和力（结合能为-9.4 kcal/mol）和稳定的结合构象。
9. Kakkalide通过上调SIRT3促进活化BV2小胶质细胞的线粒体自噬
实验证实，Kakkalide能剂量依赖性地逆转LPS引起的SIRT3表达下降。更重要的是，敲低SIRT3会完全抵消Kakkalide对BNIP3/NIX/LC3-II的上调和对P62的下调作用，而过表达SIRT3则能增强这些效应。同时，线粒体自噬的激活或抑制并不影响SIRT3水平，说明SIRT3作用于该通路的上游。
10. Kakkalide通过SIRT3依赖的途径促进脊髓损伤后功能恢复
在体实验中，联合使用SIRT3抑制剂3-TYP，可以显著削弱Kakkalide在促进运动功能恢复、减轻组织损伤、增强线粒体自噬以及诱导小胶质细胞M2极化方面的所有有益效果，从而在整体动物水平证实了SIRT3是Kakkalide发挥治疗作用不可或缺的核心媒介。
结论与讨论部分对本研究进行了总结与展望。该研究首次系统阐明了天然化合物Kakkalide在脊髓损伤治疗中的新机制：它通过靶向并上调SIRT3，激活BNIP3/NIX依赖的线粒体自噬途径，清除功能障碍的线粒体，维持线粒体稳态，从而驱动小胶质细胞由促炎的M1表型向抗炎、促修复的M2表型转化，最终减轻神经炎症、促进组织修复和功能恢复。这一发现不仅为理解Kakkalide的神经保护作用提供了全新的视角，更重要的是，它揭示了“SIRT3-线粒体自噬”轴是调控神经炎症的一个潜在可行靶点，为开发以天然产物为基础、靶向免疫代谢重塑的脊髓损伤治疗新策略奠定了坚实的理论基础。论文也客观指出了研究的局限性，如未设置阳性药物对照、仅使用了雌性小鼠模型、给药途径为腹腔注射而非更接近临床的口服给药等，为未来更深入的转化研究指明了方向。
