从腐殖质土壤中新分离出的Actinophytocola sp. KF-1菌株的特性研究——该菌株是一种能够降解多羟基烷酸的细菌

《Polymer Degradation and Stability》：Characterization of Actinophytocola sp. Strain KF-1, Newly Isolated from Humus Soil as Polyhydroxyalkanoate-Degrading Bacterium

可降解塑料聚羟基烷酸酯（PHAs）中3H2MB基材料因优异性能受关注，但生物降解机制尚不明确。本研究鉴定出降解低分子量3H2MB基塑料的新菌种Actinophytola sp.（KF-1），通过16S rRNA测序和形态学确认分类地位，基因组分析发现3个潜在降解基因，其中phaZ基因在大肠杆菌重组系统中显示酯酶和 depolymerase活性，ELISA验证其在KF-1中表达，揭示其参与3H2MB基PHA降解。

　　

Ramamoorthi M. Sivashankari | Sayaka Endo | Junichi Kamoi | Sho Furutate | Manami Ishii-Hyakutake | Yuki Miyahara | Shin-Ichi Hachisuka | Takeharu Tsuge

东京理科大学材料科学与工程系，日本横滨市绿区长津田4259，邮编226-8501

摘要

可生物降解塑料，尤其是聚羟基烷酸酯（PHAs），由于能够在多种环境中降解，因此成为传统石油基塑料的可持续替代品。在PHAs中，基于3-羟基-2-甲基丁酸（3H2MB）的聚合物在作为塑料材料时表现出实用的热性能和机械性能；然而，对其生物降解机制的理解仍然有限。在我们之前的研究中，从腐殖土中分离出了一种名为KF-1的细菌，该细菌能够降解低分子量的3H2MB基聚合物。本研究对KF-1菌株进行了表征。根据16S rRNA基因序列和形态观察，该菌株被鉴定为Actinophytocola属。尽管该菌株在液体培养中的PHA降解活性较低，但在琼脂平板上的菌落与PHA薄膜接触时能够侵蚀薄膜表面。因此，KF-1菌株需要与PHA聚合物进行长时间、密切的接触才能实现降解。我们对KF-1菌株的基因组进行了测序，并发现了三个可能与PHA降解相关的基因。利用大肠杆菌重组表达系统检测了这些基因产物的PHA降解活性。其中一个基因产物与Paucimonas lemoignei的PHA解聚酶（PhaZ1）相似，但缺乏底物结合域和连接域，仍表现出对3H2MB基聚合物的降解活性。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）证实了该基因在KF-1菌株中的表达。这些结果强烈表明该基因参与了PHA的降解过程。

引言

塑料是现代社会不可或缺的一部分，广泛应用于从日常消费品（如购物袋、塑料瓶和家用电器）到汽车、航空航天和电子行业的工业组件等各种领域。然而，塑料处理对环境的影响已成为一个全球性的问题[1]。塑料不可生物降解，在生态系统中可存在数百年甚至数千年。研究表明，全球每年产生的塑料垃圾量约为17至19亿吨，并预计到2050年将增加到270亿吨[2]，海洋生物尤其容易受到塑料碎片的影响，导致消化阻塞和身体伤害。此外，塑料会分解成微塑料，进入食物链，从而加剧生物放大效应并破坏生态系统[3]。此外，陆地环境中的塑料垃圾会释放有毒化学物质，导致土壤污染[4]。因此，开发可持续的塑料替代品迫在眉睫。

来自可再生生物质来源的可生物降解塑料正受到关注，被视为传统石油基塑料的潜在替代品。生物质（包括植物和动物材料）通过光合作用实现自然碳固定，形成碳中和循环。分解过程中，生物质被微生物分解为CO₂，重新释放到大气中，维持碳平衡。在可生物降解的生物质塑料中，聚乳酸（PLA）和聚羟基烷酸酯（PHAs）尤为引人注目。特别是PHA，因为它们不仅能在土壤中降解，还能在海洋环境中降解[5,6]，而PLA则需要特定的堆肥条件。尽管具有这些环境优势，但由于生物质的分散和运输、较高的生产成本以及某些工业应用中材料性能不佳等问题，可生物降解生物质塑料的广泛应用仍受到限制。目前正在进行研究，以提高制造效率、降低成本并改善这些塑料的材料性能。PHA是一类由微生物合成的聚酯类化合物，作为细胞内能量储存物质，具有很好的应用前景。这些聚合物在碳源充足的情况下，在营养限制条件下生成，并在营养耗尽时被微生物降解以供能量利用。PHA的结构相对简单，但已鉴定出超过160种不同的单体单元[7]，使得PHA家族具有相当大的多样性。聚(3-羟基丁酸) [P(3HB)]是最广泛研究的PHA之一，1925年在Bacillus megaterium中首次被发现[8]。然而，P(3HB)的结晶速率低、结晶度高且脆性大，限制了其实际应用。此外，其耐热性差，熔化和加工时容易降低分子量[9]。相比之下，2021年报道的聚(3-羟基-2-甲基丁酸) [P(3H2MB)]表现出更好的性能，如更快的结晶速率、更高的耐热性和更好的柔韧性[10]，使其比P(3HB)更具潜力[11]。P(3H2MB)的断裂伸长率与常见的石油基塑料（如聚丙烯PP和高密度聚乙烯HDPE）相当，分别为620%和550%[10]。然而，P(3H2MB)的生产效率较低，导致生产成本较高，限制了其商业可行性[11,12]。另一方面，通过化学合成制备的α-甲基化PHA因其优异的物理性能和可回收性而受到关注[13]。

尽管存在这些挑战，基于3H2MB的聚合物仍因其优异的物理性能而受到关注。然而，作为一种相对较新的材料，关于3H2MB基聚合物的许多方面仍不清楚，尤其是在其生物降解性方面。为了证明其实用性，必须证明微生物能够降解3H2MB基聚合物。本研究调查了KF-1菌株，该菌株在我们之前的研究中从腐殖土中分离出能够降解低分子量3H2MB基聚合物[10]。首先，根据16S rRNA基因序列和形态观察，将KF-1菌株鉴定为Actinophytocola属。通过液体培养和琼脂平板实验研究了该菌株对3H2MB基聚合物的降解能力。此外，对KF-1菌株的基因组进行分析，发现了三个可能与PHA降解相关的基因。利用大肠杆菌重组表达系统检测了这些基因产物的酯酶和PHA解聚酶活性。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）证实了最可能与PHA降解相关的基因的表达。这些结果强烈表明该基因参与了PHA的降解过程；因此，我们将其鉴定为PHA解聚酶基因（phaZ_KF-1）。

材料

本研究根据先前的研究[9,10]合成了P(79 mol% 3H2MB-co-3HB)（M_n 152,000, M_w/M_n 2.3）和P(3H2MB）（M_n 258,000, M_w/M_n 2.1）。P(3HB）（M_n 190,000, M_w/M_n 2.1）购自美国密苏里州克雷夫库尔的Monsanto公司。PHA薄膜采用溶剂浇铸法制备。

用于PHA降解实验的两种细菌Pseudomonas stutzeri YM1006（JCM 10168）和Ralstonia picketii T1（JCM 10169）来自JCM（日本微生物收藏中心）

KF-1菌株的16S rRNA分析

KF-1菌株之前从日本横滨市的腐殖土中分离出来，是一种能够降解3H2MB基聚合物的细菌[10]。首先，为了初步了解该菌株的培养特性，我们在30°C和37°C下使用多种培养基进行了试管培养。在LB、NR和ISP1培养基中，NR培养基下的生长最好。当加入20 g/L甘油后，37°C培养96小时后，细胞生长达到最高光密度（OD₆₀₀=35）

讨论

塑料在现代社会中扮演着关键角色。然而，由于其不可生物降解且不易在环境中降解的特性，导致了严重的生态问题，包括海洋污染、微塑料积累和土壤污染。可生物降解塑料，尤其是PHA，由于能够在多种环境中降解，因此成为传统石油基塑料的可持续替代品。在PHAs中，基于3H2MB的聚合物表现出实用的热性能和机械性能

结论

根据16S rRNA基因序列和形态观察，一种新的PHA降解细菌KF-1被鉴定为Actinophytocola属。KF-1菌株在含有P(3HB)粉末的琼脂平板上形成清晰的分界区，并在与PHA薄膜接触时表现出对薄膜表面的侵蚀作用。另一方面，KF-1菌株在液体培养中未显示出对P(3HB)粉末的降解活性。对KF-1菌株的基因组进行测序，以鉴定编码PHA解聚酶的基因。研究发现

资金支持

本研究得到了新能源和工业技术发展组织（NEDO，JPNP18016项目，资助给T.T.）的支持。

作者贡献声明

Ramamoorthi M. Sivashankari：撰写初稿、数据可视化、验证、方法论设计、实验研究、数据分析、数据整理。 Sayaka Endo：实验研究、数据分析、数据整理。 Junichi Kamoi：方法论设计、实验研究、数据分析、数据整理。 Sho Furutate：资源提供、实验研究。 Manami Ishii-Hyakutake：方法论设计、实验研究、数据整理。 Yuki Miyahara：验证、方法论设计、实验研究、数据整理。 Shin-Ichi Hachisuka：验证、方法论设计。

利益冲突声明

作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益和个人关系：

Takeharu Tsuge表示获得了新能源和工业技术发展组织的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢东京理科大学的Wachi Masaaki教授和Iwai Noritaka教授在提取KF-1菌株基因组方面的指导。测序反应和分析工作委托给了东京理科大学技术支持部的生物组。