Vibrio MO245外多糖/壳聚糖水凝胶用于海洋防污涂层

《Progress in Organic Coatings》：Vibrio MO245 exopolysaccharide/chitosan hydrogel for marine antifouling coating

生物污垢是海洋工业的主要问题，传统有毒防污涂层被限制使用。本研究开发基于壳聚糖的水凝胶涂层，通过引入亲水性多糖（如MO245多糖和海藻酸）优化防污性能。通过拓扑结构、交联度、亲水性等表征，并测试大肠杆菌、硅藻和牡蛎幼虫附着情况，结果表明MO245多糖在防污效果上优于海藻酸，同时保持环保无毒性。

　　

玛丽·尚皮翁（Marie Champion）|泽维尔·莫佩尔特（Xavier Moppert）|奥古斯丁·里奥斯·德安德拉（Agustin Rios de Anda）|塞娜·哈尔马迪（Sena Harmadi）|克莱尔·埃利奥（Claire Hellio）|伊莎贝尔·利诺塞（Isabelle Linossier）|卡琳·瓦莱-雷埃尔（Karine Vallée-Réhel）|法比安·费（Fabienne Fa?）

海洋生物技术与化学实验室（Laboratoire de Biotechnologie et Chimie Marines, LBCM），法国国家科学研究中心EMR 6076项目，布雷塔尼南部大学（Université Bretagne Sud），56321，洛里昂（Lorient），邮政信箱

摘要

生物污损是海洋工业中的一个主要问题。由于有毒防污涂料对环境的负面影响，开发环保且不含杀生物剂的替代品变得十分必要。基于多糖的水凝胶涂层作为一种替代方案，正受到广泛关注。这类涂层被认为具有很好的前景，因为它们环保且密集的水合层能够有效防止生物污损。本研究报道了一种优化的壳聚糖基水凝胶涂层，通过添加亲水性多糖来提升其防污性能。实验比较了来自Vibrio MO245的细菌外多糖与众所周知的透明质酸的性能。在介绍了涂层的制备过程（包括MO245的降解）后，通过形貌测量、交联分析、水合能力分析和疏水性分析对涂层进行了表征。随后，评估了该涂层对三种代表性生物的防污效果：细菌Vibrio harveyi、硅藻Cylindrotheca closterium以及牡蛎幼虫Magallana gigas。

引言

生物污损是一个自然且动态的过程，始于矿物质和有机化合物在浸没表面的物理化学吸附，随后各种生物（包括细菌、微藻、大型藻类和无脊椎动物）附着并定殖。生物污损会导致不希望出现的经济和环境问题，例如增加船舶燃料消耗、加速船体及海洋基础设施的腐蚀、降低热交换器的效率以及外来物种的扩散。为了减轻生物污损生物的附着，人们广泛研究了防污（AF）和污损释放（FR）涂层。在针对海洋生物污损的环保策略中，柔软湿润的材料（如水凝胶）受到了显著关注[1]、[2]、[3]。郭等人制备了基于聚(N-乙烯基吡咯烷酮)和聚(二甲基硅氧烷)（PDMS）的交联两亲网络[4]；杨等人提出了一种基于聚丙烯酰胺和多臂聚乙二醇（PEG）的强韧且可涂覆的水凝胶涂层，该涂层通过结合亲水表面的防污效果与污损释放机制及缓慢的自抛光特性来抑制微生物附着[5]；薛等人设计了一种具有光滑、自清洁、抗油和自我修复特性的防污水凝胶涂层[6]；何等人最近描述了一种通过将辣椒素衍生物功能化聚合物而制备的高效环保水凝胶涂层[7]。

水凝胶是一类柔软的聚合物材料，其特点是具有三维（3D）交联网络，其中水作为主要分散介质。它们的分子链富含亲水基团，赋予了出色的吸水保水能力以及柔软性和弹性等独特机械性能[8]。由聚合物亲水基团和水形成的水合层起到了物理和能量屏障的作用，抑制了微生物和大型生物的附着[1]。然而，这种综合策略在防止多种生物长期定殖方面仍存在不足[9]、[10]。因此，开发具有多种防污机制的防污水凝胶是当务之急。为了提升其防污性能，研究人员正在探索多种组合机制。防污水凝胶的五种主要机制包括：水合层、低弹性模量、微/纳米结构、防污化合物的存在以及自我修复表面[8]、[11]。针对这些不同机制的目标生物种类繁多，获取最佳纳米/微结构具有挑战性，且大规模制备受到限制。自我修复表面可能是结合水凝胶和自抛光涂层双重防污机制的一种有前景的方法[6]、[12]，但这一策略仍处于探索阶段。引入生物活性化合物可以提升防污性能[13]、[14]、[15]、[16]，不过某些化合物具有生物毒性，对海洋生物有害。此外，工业中防污化合物的使用受《生物杀灭产品法规》（EU）528/2012的监管。因此，需要寻找替代生物杀灭的方法。将水合层与低弹性模量结合，并结合无毒生物聚合物的固有特性，可能是一种有前景的方法。

尽管合成化合物（价格低廉、大分子结构可控）在制备防污水凝胶方面具有优势[17]，但其有限的生物相容性和环境兼容性限制了其在特定环境中的有效性。相比之下，天然化合物因其生物相容性、可生物降解性、固有的抗菌性能和亲水性而受到越来越多的关注，成为开发防污水凝胶的关键成分[1]。其中，壳聚糖（CH）是一种从壳聚糖脱乙酰化得到的阳离子多糖，已被广泛用于合成具有不同结构和特性的各种化学和水凝胶[1]。最近，我们提出了基于壳聚糖和柠檬酸（CA）的水凝胶涂层[18]。这些水凝胶非常柔软（约1 kPa），根据CA的含量不同，能够通过非生物杀灭机制阻止或促进细菌附着。

透明质酸（HA）是一种非硫酸化的糖胺聚糖，富含羟基，被认为是低污损材料，特别适合生物医学应用。HA可以接枝到基底上[19]或交联形成水凝胶[20]。Vigué等人证明，E. coli在柔软的HA水凝胶上的附着和滞留程度低于PDMS[21]。此外，多项研究探讨了透明质酸和壳聚糖在多层涂层中的应用[22]、[23]。

MO245是一种由Vibrio属细菌合成的外多糖（EPS），最初从莫雷阿岛（Moorea Island）收集的细菌菌垫中分离得到[24]。MO245 EPS是一种柔性的聚电解质，其结构和性质类似于透明质酸。它主要由葡萄糖酸、N-乙酰半乳胺和N-乙酰葡萄糖胺以2:1:1的比例组成，这与透明质酸的比例相同（葡萄糖酸与己糖胺的比例相同）。其糖苷键结构也类似，表现为1 → 3和1 → 4键的交替。与细菌外多糖类似，MO245的分子量非常高，可达10^6 g/mol。先前的研究表明，MO245作为一种抗生物膜化合物具有潜力，但无生物杀灭活性。EPS改变了细菌与表面之间的物理化学相互作用，起到非吸附层的作用。MO245 EPS比HA更有效[25]。此外，MO245在与铜二价阴离子反应时能形成坚固的水凝胶[26]。

在这项研究中，我们采用了一种简单的一锅法合成了新型的混合交联网络水凝胶涂层。与单一网络相比，混合网络水凝胶通常具有更好的机械和防污性能[27]、[28]。该网络主要由高分子量的壳聚糖组成，并添加了第二种低分子量聚合物（MO245d或HA）作为添加剂。根据结构和物理化学性质对涂层进行了表征，随后评估了其防污效果。实验选用了Vibrio harveyi细菌、Cylindrotheca Closterium硅藻细胞和Magallana gigas牡蛎幼虫作为代表三种不同系统发育群的生物。Vibrio harveyi DSM19623是一种运动性的革兰氏阴性菌，对鱼类和多种海洋无脊椎动物具有致病性[3]。Cylindrotheca closterium是一种底栖硅藻，是常见于防污涂层上的主要硅藻成分[29]。Magallana gigas（Thunberg, 1973）是一种广泛用于水产养殖的牡蛎物种[30]、[31]，其浮游幼虫在变态前会附着在表面[32]。这是一种高经济价值的滤食性物种，常被用作海洋环境状况的生物指示剂[33]。本研究评估了MO245在海洋防污应用中的生物技术潜力。

材料

商业壳聚糖（3.10^4 g/mol和2.5.10^5 g/mol）和透明质酸（5.10^4 g/mol）（图1 A, B）购自Glentham Life Sciences（英国）。MO245由PacificBiotech提供（图1C）。柠檬酸由TCI（法国）提供。醋酸和Tris-HCl购自Roth（法国）。磷酸氢钠、磷酸钾、氯化铵、氯化镁、硫酸镁、L-精氨酸、盐酸多巴胺和玻璃载玻片也由该公司提供

涂层的制备

涂层分为两层，如图2所示。首先对玻璃基底进行表面处理以增强涂层附着力[38]。因此，第一层是多巴胺（PDA）涂层，确保水凝胶牢固地附着在基底表面，这一点在之前的壳聚糖水凝胶涂层研究中已有验证[18]。该功能化过程中涉及基底（玻璃）与水凝胶涂层之间的反应

CRediT作者贡献声明

玛丽·尚皮翁（Marie Champion）：研究工作、软件开发。 泽维尔·莫佩尔特（Xavier Moppert）：研究工作。 奥古斯丁·里奥斯·德安德拉（Agustin Rios de Anda）：数据分析、研究工作。 塞娜·哈尔马迪（Sena Harmadi）：数据验证、可视化处理。 克莱尔·埃利奥（Claire Hellio）：数据验证、可视化处理。 卡琳·瓦莱-雷埃尔（Karine Vallée-Réhel）：数据验证、可视化处理。 法比安·费（Fabienne Fa?）：数据管理、资金筹集、方法论设计、监督工作、数据验证、初稿撰写、审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本项工作得到了布雷塔尼南部大学、布雷塔尼大区（ARED BIOPS和太平洋生物技术公司（French Polynesia）的支持。我们要感谢以下人员的帮助：Hugo Koechlin（IFREMER, Argenton）在幼虫培养方面的支持；Anthony Magueresse（IRDL, 布雷塔尼南部大学）在轮廓测量分析方面的协助；以及Jean Guezennec在EPS分析方面的重要贡献。