《Redox Biology》：ROS disrupt COP9 signalosome-mediated ABCA1 protection and trigger its ubiquitination and degradation by cullin3 inhibiting cholesterol efflux and promoting foam cell formation in response to GPCR agonists
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本研究揭示了GPCR激动剂（如thrombin和Ang II）如何通过一种新的分子机制破坏胆固醇逆向转运。研究人员发现，在病理刺激下，活性氧（ROS）依赖的信号通路导致关键胆固醇转运蛋白ABCA1与COP9信号体解离，转而与cullin3结合，进而发生泛素化降解。这一过程抑制了胆固醇流出，促进了泡沫细胞的形成，为动脉粥样硬化等心血管疾病的发病机制提供了新的见解，并提示靶向此通路可能成为新的治疗策略。
想象一下，你体内的血管是一条条繁忙的“高速公路”，负责运输生命所必需的养分和氧气。然而，当这条“公路”上堆积了过多“垃圾”——主要是脂质，特别是胆固醇时，就会发生“交通堵塞”，形成动脉粥样硬化斑块，最终可能引发心肌梗死或中风。在清理这些“垃圾”的过程中，一类名叫ABC（ATP-binding cassette）的转运蛋白家族扮演着至关重要的“清道夫”角色，其中ABCA1尤为关键。它负责将细胞（如巨噬细胞、血管平滑肌细胞）内过多的胆固醇转运出来，交给被称为“好胆固醇”载体——高密度脂蛋白（HDL）的前体apoA-I，这个过程称为胆固醇流出，是防止胆固醇在动脉壁内蓄积、形成“泡沫细胞”乃至粥样硬化斑块的核心防御机制。然而，在动脉粥样硬化的病理环境中，ABCA1的稳定性会受到破坏。之前的研究已经发现，某些激活G蛋白偶联受体（GPCR）的分子，如凝血酶（thrombin），会促使ABCA1被一个名为cullin3的蛋白质标记上“垃圾标签”（泛素化），然后被送到细胞内的“粉碎机”（蛋白酶体）降解掉。同时，一个叫做COP9信号体（CSN）的蛋白质复合物则像一位“保护者”，能够阻止cullin3对ABCA1的破坏。
那么，一个核心科学问题就浮出水面：COP9信号体究竟是以其完整的复合体形式，还是以单个亚基的形式来保护ABCA1的？GPCR激动剂又是通过什么样的精确分子“开关”，来“撬开”这位保护者，将ABCA1推向被降解的命运？这个“开关”是否也适用于其他重要的病理刺激物，比如与高血压密切相关的血管紧张素II（Ang II）？解决这些问题，不仅有助于我们更深刻地理解动脉粥样硬化的发病机理，还可能为寻找新的治疗靶点指明方向。
为了解答这些谜题，由Suresh Govatati等人组成的研究团队进行了一项深入的研究，他们的成果发表在国际知名期刊《Redox Biology》上。他们的研究揭示了一条此前未知的信号通路：GPCR激动剂通过激活黄嘌呤氧化酶，产生活性氧（ROS，特别是H2O2），从而像一把“钥匙”一样，开启了ABCA1从被保护到被销毁的转变过程。
研究者们综合运用了多种细胞与分子生物学技术来探索这一机制。他们使用了小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）和小鼠主动脉平滑肌细胞（MASMCs）作为体外模型，并利用载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠的动脉样本以及人类非狭窄性与狭窄性（晚期病变）冠状动脉切片进行体内验证。核心技术手段包括：蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析蛋白表达与磷酸化水平；免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）技术探测蛋白质间的直接相互作用；原位邻近连接 assay (Proximity Ligation Assay, PLA) 在细胞原位高灵敏度地可视化蛋白质复合物；小干扰RNA（siRNA）和质粒过表达技术进行基因功能的丧失与获得研究；使用黄嘌呤氧化酶特异性抑制剂别嘌呤醇（allopurinol）进行药理学干预；以及胆固醇流出 assay和泡沫细胞形成 assay来评估最终的功能学后果。
研究结果
2.1. 凝血酶触发COP9信号体与ABCA1解离并与cullin3结合
在基础状态下，ABCA1与COP9信号体的多个亚基（CSN1, CSN2, CSN3, CSN4, CSN5）形成复合物。当用凝血酶处理细胞后，ABCA1发生磷酸化，并从所有这些CSN亚基上解离下来，转而与cullin3结合。这一结果表明，COP9信号体是作为一个整体复合物（而非单个亚基）来稳定ABCA1的。研究还发现，凝血酶选择性地降低ABCA1水平，而不影响其他胆固醇转运蛋白如ABCG1和SR-B1。
2.2. 过表达CSN5可恢复ABCA1水平及胆固醇流出，并减少泡沫细胞形成
作为COP9信号体的催化核心亚基，CSN5的强制表达能够阻止凝血酶诱导的ABCA1磷酸化，恢复ABCA1与CSN5的相互作用，并抑制其与cullin3的结合，从而稳定ABCA1蛋白水平。功能上，CSN5过表达也成功挽救了因凝血酶抑制的胆固醇流出，并减少了泡沫细胞的形成。
2.3. Par1-Gα12-Pyk2-Gab1-PKCθ信号轴在凝血酶诱导的ABCA1不稳定化中的作用
研究人员证实，凝血酶通过其受体Par1，激活下游的Gα12-Pyk2-Gab1-PKCθ信号级联反应。利用siRNA敲低这条通路上的任何一个关键分子（Par1, Gα12, Pyk2, Gab1或PKCθ），都能有效抑制凝血酶引起的ABCA1磷酸化、其与CSN5的解离以及与cullin3的结合，从而阻止ABCA1的降解。
2.4. ROS在凝血酶诱导的ABCA1下调中的作用
研究发现，凝血酶能够诱导细胞内H2O2的产生，并且上调黄嘌呤氧化酶的表达。使用黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇可以阻断H2O2的生成，并同时抑制凝血酶导致的ABCA1磷酸化、与CSN5解离、与cullin3结合、泛素化降解等一系列事件，进而恢复胆固醇流出并减少泡沫细胞形成。进一步的机制定位表明，黄嘌呤氧化酶位于Gα12的下游和Pyk2的上游。
2.5. 尿酸在凝血酶诱导的ABCA1不稳定化中无作用
为了区分黄嘌呤氧化酶产物中的作用分子，研究发现H2O2能够模拟凝血酶的作用，诱导ABCA1不稳定化并抑制胆固醇流出；而黄嘌呤氧化酶的另一个产物尿酸则没有这些效应。这明确了H2O2是介导该过程的关键活性氧成分。
2.6. Ang II通过下调ABCA1抑制胆固醇流出并增加泡沫细胞形成
研究将模型扩展到另一种重要的GPCR激动剂——血管紧张素II（Ang II）。结果显示，Ang II能够引发与凝血酶完全相同的效应：诱导ABCA1磷酸化，使其与COP9信号体（CSN1-CSN5）解离，转而与cullin3结合，导致其泛素化降解，最终抑制胆固醇流出并促进泡沫细胞形成。同样，Ang II的作用也依赖于黄嘌呤氧化酶产生的H2O2，并且能够被CSN5过表达所逆转。
2.7. AT1R-Gα12-Pyk2-Gab1-PKCθ信号轴在Ang II诱导的ABCA1不稳定化中的作用
Ang II通过其受体AT1R发挥作用。研究发现，Ang II激活了AT1R-Gα12-Pyk2-Gab1-PKCθ这条与凝血酶Par1受体下游相似的通路。抑制AT1R（使用药物氯沙坦）或敲低Gα12、Pyk2、Gab1、PKCθ均能阻断Ang II对ABCA1的破坏作用。黄嘌呤氧化酶同样被定位于此通路中Gα12的下游和Pyk2的上游。
2.8. CSN5-ABCA1相互作用在小鼠和人类动脉粥样硬化病变中被破坏
为了将体外发现推向生理病理环境，研究者检查了动物模型和人类样本。在高脂饮食（WD）喂养的ApoE-/-小鼠的主动脉中，以及人类晚期动脉粥样硬化（狭窄性）冠状动脉切片中，ABCA1与CSN5的共定位显著减少，而与cullin3的共定位有增加趋势。这直接证明了该分子机制在体内动脉粥样硬化病变中的相关性。
研究结论与重要意义
本研究系统地阐明了GPCR激动剂（如thrombin和Ang II）破坏胆固醇逆向转运、促进动脉粥样硬化的一个全新分子机制。其核心结论在于：在病理刺激下，COP9信号体作为一个完整的复合物（而非单个亚基）结合并保护ABCA1，使其免于被cullin3介导的泛素化降解系统破坏。而GPCR激动剂通过激活其受体（Par1或AT1R），启动Gα12-Pyk2-Gab1-PKCθ信号轴，并关键性地通过上调黄嘌呤氧化酶产生活性氧H2O2。H2O2作为关键的信号分子，触发了ABCA1的磷酸化，导致其从保护者COP9信号体上“脱落”，转而与“执行者”cullin3结合，最终被泛素化标记并送往蛋白酶体降解。ABCA1的减少直接削弱了细胞的胆固醇流出能力，导致脂质蓄积，形成泡沫细胞——动脉粥样硬化的早期标志。
这项研究的重大意义在于：首先，它首次揭示了COP9信号体作为整体复合物在稳定ABCA1、抗动脉粥样硬化中的关键作用。其次，它发现了黄嘌呤氧化酶依赖的ROS产生是连接GPCR激活与ABCA1降解的一个全新上游枢纽。第三，它证明多种重要的GPCR激动剂（thrombin和Ang II）共享这一条保守的信号通路来破坏胆固醇代谢，这解释了多种心血管危险因素（如凝血异常、肾素-血管紧张素系统激活）可能汇聚于同一致病环节。最后，研究在动物模型和人类病变组织中验证了该机制的病理相关性，极大地增强了其临床转化潜力。这些发现不仅深化了对动脉粥样硬化发病机制的理解，更为开发新的治疗策略提供了潜在的靶点：例如，增强COP9信号体功能、抑制黄嘌呤氧化酶或阻断其下游信号通路，可能成为稳定ABCA1、促进胆固醇流出、从而防治动脉粥样硬化的新途径。
