《Redox Biology》：Bidirectional coupling of neuronal Ca2+ and nitric oxide signals visualized by a dual biosensor
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神经元信号转导中钙离子（Ca2+）与一氧化氮（NO）的动态关系一直是神经科学的未解之谜。为解决在近生理条件下对二者进行同步、高灵敏度实时成像的难题，本研究开发了一种基于AAV的双顺反子双生物传感器，将jGCaMP8s Ca2+指示剂与O-geNOps NO报告基因相结合，并在原代海马神经元中实现了同步成像。研究发现，自发或轻微的Ca2+活动不足以激活神经元型一氧化氮合酶（nNOS），而强烈的去极化（如50 mM KCl）则可引发远超外源性NO供体的内源性NO爆发性产生。反之，无论是内源还是外源性NO，均能显著抑制神经元的自发性Ca2+放电。该研究首次在原代神经元中直观揭示了Ca2+与NO信号之间的阈值依赖性双向功能偶联，为理解神经元兴奋性、氧化还原平衡与能量需求的协调机制提供了重要工具和新见解。
在复杂而精密的神经元王国里，有两类至关重要的“信使”在忙碌地传递着信息，它们分别是无处不在的钙离子（Ca2+）和能自由穿透细胞膜的“气体信使”一氧化氮（NO）。Ca2+掌管着神经元的兴奋、递质释放乃至基因表达，而NO则能调节从线粒体呼吸到局部血流的广泛过程。二者关系紧密：Ca2+通过激活神经元型一氧化氮合酶（nNOS）来“命令”NO的生成；反过来，NO又可以通过多种途径“调控”Ca2+的内流与稳态。这种双向对话被认为是协调神经元电活动、能量代谢与氧化还原平衡的核心枢纽。然而，当这种精妙的平衡被打破——例如在脑缺血、创伤性脑损伤或阿尔茨海默病等神经退行性疾病中——过量的Ca2+可能导致NO的过度产生，进而引发氧化应激和神经元损伤。
尽管其重要性不言而喻，科学家们长期以来却像隔着毛玻璃观察，难以清晰、同步地捕捉这对信使在活神经元中的实时动态“对话”。传统的化学NO探针往往响应慢、特异性有限，而将Ca2+与NO的基因编码指示剂在同一个神经元中稳定、等量地表达更是一大技术挑战。此外，绝大多数体外研究都在大气氧浓度（约21 kPa O2）下进行，这与大脑实际的生理氧环境（约1-5 kPa O2，又称生理性低氧）相去甚远，可能严重扭曲NO的生物利用度和相关信号。因此，开发一种能在近生理条件下对神经元内Ca2+和NO进行高灵敏度、双通道实时成像的工具，并借此揭示它们之间的动态耦合规律，成为了领域内一个亟待攻克的前沿难题。
为了回答这些问题，由Emrah Eroglu团队领导的研究在《Redox Biology》上发表了一项重要工作。研究人员开展了一项综合性研究，核心是开发并应用一种新型的双功能成像工具。他们首先通过免疫染色比较了不同神经组织，确定原代海马神经元具有最丰富的nNOS表达，因而选作研究模型。为解决双指标共表达难题，他们创新性地设计并构建了一个双顺反子腺相关病毒（AAV）载体，将橙色的NO生物传感器O-geNOps与高灵敏度的绿色Ca2+指示剂jGCaMP8s通过一个自切割的P2A肽段连接，确保它们在同一个神经元中被等量表达。研究特别强调了环境控制的重要性，将神经元培养和成像条件优化至生理性氧浓度（5 kPa O2）和生理温度（37°C）。利用这个平台，他们系统探究了不同强度电生理和化学刺激下，单个海马神经元内Ca2+与NO信号的产生与相互调控。
本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 分子构建与病毒制备：构建了携带O-geNOps-P2A-jGCaMP8s双顺反子表达盒的AAV2/9病毒。2. 原代神经元培养与模型选择：培养了来自新生小鼠的海马、皮层、小脑以及成年小鼠背根神经节的原代神经元，并通过免疫染色确定海马神经元为高表达nNOS的模型系统。3. 近生理条件控制：在生理性低氧（5 kPa O2）培养箱中长时间培养神经元，并在控温控氧的成像系统中进行活细胞实验。4. 活细胞双通道荧光成像：使用宽场荧光显微镜，在单细胞水平同步记录jGCaMP8s（Ca2+）和O-geNOps（NO）的荧光变化，以响应不同刺激。5. 免疫荧光染色与共聚焦显微镜成像：用于评估不同神经元类型中nNOS蛋白的表达水平。
研究结果
1. 海马神经元富含nNOS，是研究Ca2+-NO耦合的理想模型
通过比较背根神经节、小脑、皮层和海马来源的原代神经元，免疫染色显示海马神经元的Tuj1阳性神经元中，nNOS的免疫反应性最为丰富和强烈，表明海马是研究内源性NO信号的合适体系。
2. 双顺反子生物传感器实现Ca2+与NO的稳定同步成像
研究人员构建了由hSyn启动子驱动，包含O-geNOps-NES、P2A肽和jGCaMP8s-NES的双顺反子载体，并包装成AAV。在原代海马神经元中，该载体实现了两种报告蛋白在胞体和神经突中的共定位表达。高钾（50 mM KCl）刺激可引发快速的jGCaMP8s（Ca2+）信号升高，以及一个稍慢但更持久的O-geNOps（NO）信号上升，证明该传感器能在同一神经元中报告Ca2+触发的内源性NO生成。2+ in hippocampal neurons.">
3. 生理性氧和温度显著增强内源性NO信号
研究比较了不同环境条件下的信号响应。在常规室温空气条件下，高钾引发的内源性NO信号较弱。当神经元在5 kPa O2下适应并仍在室温成像时，内源性NO信号显著增强，而Ca2+瞬变不变。进一步将温度升至37°C后，内源性NO响应达到最强。相反，外源性NO供体PROLI NONOate引起的O-geNOps信号在不同条件下相近。这表明生理性氧和温度主要增强了活动依赖性的内源性NO生物合成，而非传感器本身的响应性。2+ signals under physiological conditions.">
4. 强烈的Ca2+信号是激活nNOS的阈值开关，而NO反馈抑制神经元兴奋性
在优化的生理条件下，研究发现自发性Ca2+放电或由较低浓度KCl（10-30 mM）诱导的持续性Ca2+振荡，均不足以产生可被检测到的显著NO信号。然而，强烈的去极化刺激（50 mM KCl或30 μM谷氨酸）则能引发强劲的NO生成，其信号幅度甚至超过了饱和浓度的外源性NO供体。与此同时，一个关键的反馈调控被发现：无论是外源性施加的NO，还是由高钾或谷氨酸刺激产生的内源性NO，都会显著抑制神经元自发的Ca2+放电活动，直至NO信号衰减后，Ca2+放电才得以恢复。2+ and nitric oxide imaging in primary hippocampal neurons.">
研究结论与意义
本研究成功开发了一种新型的、基于AAV的双顺反子双生物传感器，首次在近生理条件下实现了对原代海马神经元内Ca2+与NO信号的同步、实时、单细胞分辨率的可视化。通过这一强大工具，研究揭示了二者之间一种动态的、具有阈值特性的双向功能偶联关系。
首先，研究明确了nNOS的激活存在一个较高的Ca2+阈值。日常的、自发的或中等强度的神经元电活动不足以“点燃”显著的NO生产，NO的爆发性生成需要强烈的、全局性的Ca2+信号（如强去极化）来触发。这符合nNOS通过钙调蛋白（CaM）激活的生物物理特性，使其扮演了“高强度活动解码器”的角色，而非对所有Ca2+波动进行线性报告。
其次，研究直观地展示了NO对神经元兴奋性的即时反馈抑制。一旦产生，无论是来自外部还是内部，NO都会迅速而有效地抑制自发的Ca2+放电活动。这为NO作为一种“刹车”信号，防止神经元过度兴奋和Ca2+超载的负反馈机制提供了直接证据。
最后，也是最具方法论意义的一点，研究强调了生理性微环境（尤其是生理性低氧和温度）对于准确捕捉神经元NO信号至关重要。在常规大气氧条件下，内源性NO信号被严重低估，这提示许多先前的研究可能未能反映大脑中NO信号的真实强度与动力学。
这项工作的意义深远。在技术层面，它提供了一种可扩展的研究平台，该双传感器设计未来可被进一步改造，用于靶向特定的细胞亚区域（如突触、细胞核），以揭示Ca2+-NO对话的空间编码规律。在生物学层面，它澄清了神经元中这两种核心信使相互作用的基本逻辑，为理解神经元如何在生理状态下协调电活动与代谢/氧化还原平衡，以及在这些耦合失调的病理状态（如神经退行性疾病、脑缺血）中发生了什么，提供了新的机制性见解。这项研究标志着我们在解码神经元内部复杂的化学语言方面迈出了关键一步。
