灵芝酸靶向髓样分化因子2（MD2）缓解神经炎症：缺血性脑卒中治疗的新策略

《Exploration》：Ganoderic Acids Alleviate Neuroinflammation by Targeting Myeloid Differentiation Factor 2 for Ischemic Stroke Therapy

本研究系统阐明了灵芝酸（GAs）通过特异性靶向髓样分化因子2（MD2），抑制小胶质细胞介导的神经炎症，从而发挥对缺血性脑卒中的保护作用。文章揭示了GA单体（尤其是GA-K）直接结合MD2、阻断MD2/TLR4复合物形成及其下游MAPK和NF-κB信号通路的全新分子机制，并通过体内外模型验证了其减轻脑缺血损伤的功效，为开发以MD2为靶点的抗卒中药物提供了坚实的实验依据和极具前景的候选分子。

　　

摘要

神经炎症在脑缺血损伤中起关键作用，是脑卒中治疗的重要靶点。灵芝酸（GAs）是从灵芝中提取的主要生物活性化合物，具有明确的抗炎特性。本研究旨在探讨GAs在缺血性脑卒中中的神经保护潜力。

1. 引言

缺血性脑卒中仍是全球主要的死亡和长期致残原因。再灌注治疗时间窗有限，且可能引发缺血/再灌注损伤。小胶质细胞介导的神经炎症在急性缺血性脑损伤中起关键作用。卒中后，小胶质细胞迅速激活，释放促炎细胞因子，加剧局部损伤并破坏血脑屏障（BBB）完整性。因此，靶向小胶质细胞介导的炎症通路是治疗缺血性脑卒中的有前景的策略。天然产物是药物发现的重要来源。灵芝酸（GAs）是来自灵芝的生物活性羊毛甾烷型三萜类化合物，具有免疫调节和抗炎等多种药理特性。本研究旨在评估GAs及其主要生物活性成分在短暂性局灶性脑缺血小鼠模型中的神经保护作用及最佳剂量。

2. 材料与方法

研究使用了从灵芝中提取的GAs，包括灵芝酸A（GA-A）、B（GA-B）、C₂（GA-C₂）、C₆（GA-C₆）、G（GA-G）、H（GA-H）、K（GA-K）和灵芝烯酸B（GNA-B），纯度均超过98%。细胞实验使用BV-2小鼠小胶质细胞系和原代小鼠小胶质细胞。动物模型采用八周龄雄性C57BL/6J小鼠建立短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型。此外，还使用了MD2基因敲除（MD2^-/-）小鼠。通过细胞活力测定、蛋白质印迹分析、神经功能测试、梗死体积和水肿评估、苏木精-伊红（HE）染色、血脑屏障通透性评估、免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）、表面等离子体共振（SPR）分析、免疫共沉淀（Co-IP）、蛋白质组微阵列分析和计算对接等多种技术手段进行研究。

3. 结果

3.1 GA减轻LPS诱导的小胶质细胞炎症激活

GAs在浓度高达200 μg/mL时对原代小鼠小胶质细胞和BV-2细胞无毒性。GAs能剂量依赖性地抑制LPS诱导的BV-2细胞中iNOS、COX-2和TNF-α的表达水平。在原代小鼠小胶质细胞中也观察到类似效果。这表明GAs在安全剂量范围内具有显著的抗神经炎症活性。

3.2 GA减轻小鼠急性脑缺血损伤

在tMCAO模型中，给予GA（5和20 mg/kg）治疗的小鼠神经功能显著改善。TTC染色显示GA显著减少了tMCAO小鼠的脑梗死体积。tMCAO诱导了严重的脑水肿，而20 mg/kg的GA治疗使水肿减少了约62.3%。组织学观察显示，GA改善了tMCAO组中紊乱的神经元排列。此外，GA剂量依赖性地减少了脑缺血后Evans蓝染料的渗出，并上调了紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，表明GA对血脑屏障完整性具有保护作用。

3.3 GA抑制缺血小鼠脑中过度激活的小胶质细胞并减少炎症

免疫组化染色显示，与假手术组相比，tMCAO组皮层缺血半暗带和海马齿状回（DG）区的Iba-1阳性细胞数量显著增加，且小胶质细胞被激活。给予20 mg/kg的GA显著减少了这两个区域的Iba-1阳性细胞数量。蛋白质印迹分析显示，tMCAO小鼠受损皮层组织中iNOS、COX-2和TNF-α的蛋白表达显著增加，而GA治疗显著降低了这些炎症介质的表达。这些结果表明GAs可以抑制脑缺血后小胶质细胞介导的神经炎症。

3.4 GA单体抑制LPS诱导的小胶质细胞中促炎细胞因子的释放

通过HPLC和UPLC-MS/MS分析，从GAs中鉴定出19种化合物。其中比例高于2%的主要化合物包括GA-A、GA-B、GA-C₂、GA-C₆、GA-G、GA-H、GA-K和GNA-B。所有GA单体在12.5至100 μM浓度范围内均无细胞毒性。在LPS刺激前用GA单体预处理BV-2细胞，能显著降低LPS诱导的TNF-α和IL-6的产生。其中，GA-K对TNF-α和IL-6释放的抑制率均超过50%，在八种GA单体中显示出最显著的抑制效果。

3.5 GA单体直接结合MD2并抑制LPS诱导的小胶质细胞中MD2/TLR4复合物形成和信号级联

SPR分析显示，八种纯化的GA单体均能与重组MD2蛋白结合，尤其是GA-K、GA-G和GA-A，其解离常数（K_d）值分别为0.47、1.20和4.74 μM。蛋白质微阵列分析证实GA-A可直接与MD2相互作用。免疫共沉淀实验表明，LPS诱导了MD2-TLR4-LPS复合物的形成，而八种不同的GA单体均能抑制该复合物的形成，其中GA-K、GA-G和GA-A显示出最佳的抑制效果。此外，LPS刺激显著提高了全细胞裂解物中ERK1/2、JNK和P38的磷酸化水平，以及核组分中NF-κB和AP-1的活化，而GAs能显著阻断LPS诱导的MAPKs/AP-1和NF-κB信号通路的激活。

3.6 与MD2强亲和力的GA-K减轻了小鼠脑缺血损伤

分子对接分析显示，GA单体分子深埋在MD2的脂质结合口袋内，并与内部疏水残基ARG-90相互作用。与SPR和免疫共沉淀分析一致，分子对接分析也显示GA-K在八种GA单体中具有最高的对接得分。体内实验表明，给予GA-K（20 mg/kg）能显著减少tMCAO小鼠的梗死体积，并改善神经功能缺损评分。

3.7 GA阻止缺血小鼠脑中MD2/TLR4复合物形成并下调MAPK和NF-κB信号通路

免疫共沉淀显示，缺血发作后皮层半暗带中MD2/TLR4复合物的量显著增加，而GA治疗阻断了缺血后脑中TLR4和MD2之间的相互作用。蛋白质印迹分析显示，GA显著降低了缺血诱导的ERK1/2、JNK和P38的磷酸化，并抑制了核内NF-κB和AP-1的表达。

3.8 MD2敲除改善小胶质细胞激活和脑缺血损伤，且GA的神经保护作用依赖于MD2

免疫荧光染色显示，与假手术组相比，缺血发作后皮层缺血半暗带和海马中MD2蛋白表达显著增加。MD2敲除小鼠在tMCAO后，皮层和海马中的Iba-1阳性细胞少于野生型小鼠。从MD2敲除小鼠分离的原代小胶质细胞在LPS诱导的炎症模型中，ERK1/2、JNK、P38和NF-κB的磷酸化以及炎症因子iNOS、COX-2和TNF-α的表达均降低。此外，MD2敲除小鼠的梗死体积更小，神经功能障碍更少。用GA处理MD2缺陷小鼠和原代小胶质细胞时，GA无法进一步减少MD2敲除tMCAO小鼠皮层和海马中的Iba-1阳性细胞，也无法进一步增强MD2敲除对神经炎症的抑制作用和对脑缺血损伤的保护作用。这清楚地表明，GAs对缺血性脑卒中的抗炎和神经保护作用依赖于MD2。

4. 讨论

本研究首次证明GA作为一类MD2的天然拮抗剂，对急性脑缺血损伤具有神经保护作用。数据显示，GAs（尤其是GA-K）可特异性与MD2相互作用，减少MD2/TLR4复合物的形成及其下游MAPK和NF-κB通路的激活，从而减少炎症介质产生并抑制小胶质细胞过度激活。MD2在缺血性脑卒中的进展中起着关键作用。研究表明，GAs能显著减少急性脑缺血损伤后小鼠小胶质细胞的激活，并在体内外抑制炎症因子产生。GAs以剂量依赖性的方式（有效剂量1.25至20 mg/kg）对急性脑缺血损伤提供保护。分子机制研究表明，GA单体可抑制TLR4特异性辅助蛋白MD2，从而阻断MAPK和NF-κB通路。分子对接研究表明，GA单体深埋在MD2的疏水口袋内，Arg-90是GA单体与MD2相互作用的关键残基。MD2不仅在LPS介导的炎症反应中起关键作用，还能识别非微生物配体。本研究发现MD2在脑缺血损伤后脑中显著过表达，敲除MD2可抑制小胶质细胞诱导的神经炎症并减轻缺血诱导的脑损伤。在八种GA单体中，GA-K对MD2的亲和力最强，对接得分最高，抗炎活性最优，提示GA-K可作为MD2的有效抑制剂。研究也存在一些局限性，例如尚未探索MD2在脑缺血损伤后除小胶质细胞外的其他细胞类型中的作用，MD2可能不是GAs治疗急性缺血性脑卒中的唯一靶点，以及需要利用原发性卒中患者的免疫细胞进一步验证临床前发现。

5. 结论

本研究结果表明，天然产物GA能在小鼠tMCAO模型中提供针对脑缺血损伤的保护。分子机制研究表明，GA单体直接与MD2的疏水口袋相互作用，从而抑制MD2/TLR4复合物的形成和激活，并随后阻断下游MAPK和NF-κB通路，有效抑制神经炎症。研究表明，GA或其单体GA-K可能通过靶向MD2开发成为治疗缺血性脑卒中的潜在治疗剂。