《SLAS Discovery》：An MRC-5 cell based high-throughput, high-content imaging assay to identify hits against
Trypanosoma cruzi intracellular parasites
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为解决现有药物副作用大、疗程长等临床瓶颈，研究人员开发了一种基于MRC-5人肺成纤维细胞的新型高通量、高内涵成像检测平台，以高通量筛选活性化合物对抗克氏锥虫(T. cruzi)胞内无鞭毛体。该研究成功鉴定出具有高选择性的先导化合物（如化合物1与化合物2），并验证了现有药物尼莫地平和齐拉西酮的抗虫活性，为开发新型安全有效的恰加斯病治疗药物提供了重要的临床前筛选工具。
在拉丁美洲，一种名为恰加斯病（Chagas disease，又名美洲锥虫病）的传染病正严重威胁着当地居民的健康。它的元凶是一种叫做克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的微小寄生虫，主要通过锥蝽的叮咬传播给人类。尽管这种疾病每年导致约1.2万人死亡，并有数万新发病例，但世界卫生组织将其列为被忽视的热带病，长期以来缺乏有效的治疗选择。目前临床上仅有两款老药可用——苯硝唑（benznidazole）和尼夫替莫克斯（nifurtimox），它们不仅疗程长达数月，还会引起严重的胃肠道不适、神经病变等副作用，导致许多患者无法完成治疗。更令人担忧的是，寄生虫对这些药物的耐药性也在逐渐出现。因此，全球的科学家们都在急切地寻找更安全、更有效的新型药物，而这一切的前提，是需要一个能够快速、准确地从海量化合物中筛选出“潜力股”的先进技术平台。
传统的药物筛选方法往往效率低下，或者无法真实模拟寄生虫在人体细胞内的生存环境。克氏锥虫的生活史复杂，其致病的关键阶段是寄生在人体细胞（如心肌细胞、巨噬细胞）内的无鞭毛体（amastigote）形式。一个理想的筛选平台，必须能同时评估化合物杀灭寄生虫的效果和对人体宿主细胞的毒性，即“选择性”。为了攻克这一难题，来自澳大利亚格里菲斯大学（Griffith University）的研究团队在《SLAS Discovery》杂志上发表了一项重要研究，他们成功开发并验证了一个基于人源MRC-5肺成纤维细胞的高通量、高内涵成像（High-Content Imaging, HCI）检测系统。该系统能在384孔板中，自动化地、定量地分析化合物对胞内克氏锥虫无鞭毛体的抑制效果，并同步评估其对宿主细胞的细胞毒性，为发现具有高选择性的新型抗恰加斯病药物提供了强大工具。
研究人员综合运用了细胞生物学、寄生虫学和高通量自动化技术。首先，他们优化了使用人源MRC-5细胞作为宿主细胞的培养和感染条件，包括细胞接种密度、寄生虫感染复数（MOI）以及溶剂DMSO的耐受浓度。随后，建立了标准化的高通量检测流程：将MRC-5细胞接种于384孔板，用克氏锥虫 Tulahuen 株的锥鞭毛体（trypomastigote）感染，形成胞内无鞭毛体感染模型。加入待测化合物孵育后，使用醛类固定剂固定细胞，并用Hoechst染料标记细胞核（宿主与寄生虫），用HCS CellMask? Green染料标记宿主细胞质。最后，利用Revvity Opera Phenix高内涵成像系统进行自动图像采集，并通过Harmony软件进行图像分析，定量计算宿主细胞总数和感染细胞数。
3.1. 确定细胞数量、感染复数和二甲基亚砜耐受性
通过条件优化，研究人员确定了在384孔板中每孔接种875个MRC-5细胞为最佳密度，能在96小时培养后达到合适的细胞汇合度。寄生虫与宿主细胞的感染复数（MOI）优化为10:1，能在保证足够感染率的同时避免因过高感染导致的细胞毒性。此外，实验明确了MRC-5细胞对化合物溶剂二甲基亚砜（DMSO）的耐受阈值为0.4%，高于此浓度会导致宿主细胞活力下降，因此后续筛选将DMSO终浓度控制在此阈值以下，以确保结果可靠性。
3.2. 参比化合物的活性
研究测试了现有药物和已知活性化合物在该新平台中的效果。结果显示，尼夫替莫克斯和苯硝唑对胞内无鞭毛体的半数抑制浓度（IC50）分别为1.63 μM和7.98 μM。作为宿主细胞毒性阳性对照的嘌呤霉素（puromycin）IC50为1.06 μM，而作为强效抗真菌药（其作用靶点CYP51在锥虫中也存在）的泊沙康唑（posaconazole）则显示出极高的体外效力。这些数据与使用小鼠3T3细胞作为宿主细胞的传统方法所得结果高度一致，验证了新平台的可靠性。
3.3. 脚本开发
为了实现高通量自动化的图像分析，研究人员开发了一套基于Harmony软件的图像分析脚本。该脚本通过多步图像处理：首先识别Hoechst染色的宿主细胞核，并通过形态学过滤排除异常核；接着，根据CellMask Green信号分割细胞质区域；最后，在细胞质区域内通过斑点检测（spot detection）识别并计数寄生虫核。为了最大程度减少背景噪音导致的假阳性，他们将一个细胞被判定为“感染”的阈值设定为胞质内含有≥5个寄生虫核。这一设定成功将非感染对照孔的假阳性信号降低了98%以上。通过统计指标（如Z‘因子、信背比）验证，即使将每孔成像视野从20个减少到5个，也能保持优异的 assay 稳健性和可重复性，同时将成像时间缩短75%，大幅提升了筛选通量。
3.4. 骨架化合物库筛选
为了验证平台的筛选能力，研究团队对一个包含1400个结构多样性化合物的骨架化合物库进行了测试。筛选在三个浓度（18.3 μM, 9.15 μM, 4.57 μM）下进行。结果显示，在最高浓度下有11个化合物显示出>88%的寄生虫抑制率（命中率0.78%），其中只有3个化合物对MRC-5细胞造成≥50%的细胞毒性，表明多数活性化合物具有选择性。在最低浓度（4.57 μM）下，仍有2个化合物保持>62%的抑制率且细胞毒性低于20%，被列为最有前景的先导化合物。其中，化合物1（一种取代的三唑并哒嗪衍生物）在所有测试浓度下均表现出强效且剂量依赖的抑制活性；而化合物2（一种含吲哚-噻唑药效团的杂芳基酰胺）则显示出类似泊沙康唑的“平台效应”，其抑制率不随浓度增加而显著提升，提示其可能具有类似的静态（而非杀灭）作用机制。
3.5. 定向化合物库筛选
为进一步探索药物重定位（drug repurposing）的可能性，研究人员筛选了一个包含290个具有明确作用机制或已知分子靶标的小分子定向库。筛选发现了两个符合被忽视疾病药物倡议（Drugs for Neglected Diseases initiative, DNDi）恰加斯病靶标候选谱（Target Candidate Profile, TCP）标准的已知药物：尼莫地平（nimodipine，一种钙通道阻滞剂，IC50= 6.86 μM）和齐拉西酮（ziprasidone，一种非典型抗精神病药，IC50= 4.74 μM）。它们的活性与既往文献报道相符，进一步证实了该筛选平台的准确性和发现已知活性物的能力。此外，研究还比较了部分化合物在MRC-5细胞与小鼠3T3细胞中的活性，结果显示出高度一致性，但使用人源MRC-5细胞能提供更具临床相关性的宿主细胞毒性数据。
结论与讨论
本研究成功建立并验证了一个基于人源MRC-5细胞的高通量、高内涵成像检测平台，用于筛选抗克氏锥虫胞内无鞭毛体的活性化合物。该平台具有高灵敏度、高重现性、高选择性以及高吞吐量的特点。其核心优势在于能够在同一孔内同时、定量地评估化合物的抗寄生虫活性和对宿主细胞的毒性，这对于发现高选择性的候选药物至关重要。通过筛选，不仅从骨架库中发现了具有新颖结构和良好选择性的先导化合物（如化合物1），也从定向库中确认了已知药物尼莫地平和齐拉西酮的抗锥虫活性，为药物重定位提供了新线索。
该研究的重大意义在于：首先，它提供了一种生理相关性更强的筛选工具。相较于常用的永生化小鼠细胞（如3T3），非转化的人二倍体MRC-5细胞能更好地模拟人体内成纤维细胞的生理状态，使得获得的效价和毒性数据更贴近临床实际情况。其次，该平台极大地提升了筛选效率和数据质量。自动化的成像与分析流程，结合优化的5视野采样策略，在保证数据可靠性的前提下实现了快速、大规模化合物筛选。最后，这项研究为加速恰加斯病新药研发提供了强大的临床前工具。该平台能够高效地从海量化合物中甄别出真正有潜力的候选分子，并提前评估其安全性，有望缩短药物发现周期，推动更多安全有效的新疗法进入临床研究，最终造福全球尤其是拉丁美洲的恰加斯病患者。
