棕榈酸诱导的PKR/JNK激活及SIRT1表达下降：与心肌老化表型变化的相关性，以及通过抑制剂实现的部分逆转

《Tissue and Cell》：Palmitic Acid-Evoked PKR/JNK Activation and SIRT1 Decline: Association with myocardial ageing phenotype changes and Partial Reversal by Inhibitors

棕榈酸（PA）诱导心肌细胞衰老的机制研究。通过MTT、流式细胞术、ROS检测等实验发现PA剂量及时间依赖性降低细胞活力，加速G1期阻滞，促进ROS堆积及SASP因子（IL-1A、IL-6等）分泌，激活PKR/JNK通路并抑制SIRT1活性。RNA测序显示衰老相关基因模块改变，PKR/JNK抑制剂可逆转部分效应。结论PA通过PKR/JNK通路和SIRT1活性抑制介导心肌细胞衰老。

　　

李文西|刘国顺|黄水金|林天海|彭成|刘峰

济南大学第一附属医院心脏病科，广州，510630，中国

摘要

目的

这项初步研究探讨了棕榈酸（PA）暴露与心肌细胞衰老相关特征之间可能的关联。

方法

细胞在0.08~0.8 mmol/L的浓度下暴露于棕榈酸中，暴露时间分别为12~72小时。使用MTT测定法评估细胞活力，通过流式细胞术分析细胞周期，并利用ROS试剂盒测量ROS水平。我们进行了SA-β-gal染色以评估SA-β-gal阳性细胞的比例。通过ELISA测定与衰老相关分泌表型（SASP）相关的因子（IL-1A、IL-6、IL-8和IFN-γ）的浓度。我们使用全转录组RNA测序技术鉴定差异表达基因（DEGs）。通过特定抑制剂（PKR-IN-C16和SP600125）研究PKR/JNK通路的参与情况。Western blotting用于分析p-PKR、PKR、p-JNK、SIRT1、p16^INK4a、p-Rb、Rb、IL-1A和IFN-γ的蛋白质表达。使用试剂盒检测SIRT1活性。

结果

细胞活力随着棕榈酸处理的剂量和时间的增加而下降。在0.19 mmol/L的棕榈酸浓度下暴露12~36小时后，G1期细胞的比例增加，而S期细胞的比例减少。ROS水平、SA-β-Gal阳性细胞的比例以及IL-1A、IL-6、IL-8和IFN-γ的浓度均升高。在0.19 mmol/L和36小时的棕榈酸处理组中，p-PKR、p-JNK、p16^INK4a、IL-1A和IFN-γ的表达增加，而p-Rb的表达降低。棕榈酸处理后SIRT1活性降低。RNA测序鉴定出与衰老相关通路相关的差异表达基因，其中SIRT1是一个关键基因模块。在PA+PKR-IN-C16组中，p-PKR、p-JNK、p16^INK4a、IL-1A、IFN-γ和SA-β-Gal的蛋白质表达低于PA组；在PA+SP600125组中，p-JNK、p16^INK4a、IL-1A和IFN-γ的蛋白质表达低于PA组，而p-PKR和SIRT1的表达高于PA组。在PA+PKR-IN-C16和PA+SP600125组中，SIRT1活性高于PA组。

结论

我们的抑制剂数据初步表明，PKR/JNK通路可能在一定程度上导致棕榈酸诱导的心肌衰老表型变化中SIRT1表达和活性的下降，尽管尚未建立明确的因果关系。

部分内容摘要

背景

心肌衰老是老年人心血管疾病的一个关键特征和独立风险因素（Boccardi和MecocciP，2020）。其特征是一系列分子和细胞变化，导致心肌收缩力和心输出量降低，最终引发心力衰竭和心血管疾病（Kida和Goligorsky，2016）。游离脂肪酸（FFAs）水平升高与心血管疾病密切相关（Lee等人，2020）。棕榈酸（PA）具有

细胞培养和处理

AC16细胞购自BeNa培养收集中心（BNCC）。细胞在含有10% FBS和1%青霉素的DMEM培养基中培养，培养条件为5% CO₂和37°C。棕榈酸（PA；MedChem Express）的储备溶液溶解在乙醇中，然后与0.5%无脂肪酸BSA在37°C下孵育10分钟，配制成0.08–0.8 mmol/L的工作浓度。0.08–0.8 mmol/L棕榈酸组中的乙醇含量约为0.02–0.2%，对细胞活力影响不大。

棕榈酸对AC16细胞活力和细胞周期调节的影响

在不同浓度（0.08–0.8 mmol/L）的棕榈酸作用下培养36小时后，细胞活力呈剂量依赖性下降（P<0.05）（图1A）。在0.19 mmol/L的棕榈酸作用下培养24–72小时后，细胞活力随时间延长而逐渐下降，48小时组的细胞活力下降超过50%（P<0.05）（图1B）。为了研究不同时间点棕榈酸对衰老表型的影响，后续实验将刺激时间缩短至12–36小时。

讨论

心肌衰老是心肌细胞结构和功能改变的关键因素，是老年人心力衰竭的重要病理生理过程。高脂血症对心肌有负面影响，脂毒性（Song等人，2017）比糖毒性（Peterson等人，2020）更具危害性。当FFA代谢紊乱时，大量脂质在心肌细胞中积累并引发脂毒性。

结论

总之，我们的研究首次发现棕榈酸的累积毒性通过激活PKR/JNK信号通路和降低SIRT1活性诱导AC16细胞的衰老表型变化。尽管这些结论需要在体内实验中得到验证，但这些体外数据为未来的动物研究提供了概念框架和方法论基础。它们阐明了紊乱的脂质代谢如何加速人类心肌细胞的衰老，并确定了SIRT1的作用。

伦理批准和参与同意

不适用

未引用的参考文献

Yang和Chan（2009）

资助

本研究得到了以下项目的支持：广州市科技计划项目“老年人慢性疾病综合社区预防和控制平台建设与新技术开发”（项目编号：201704020105）；广州市科技计划项目“基于放射基因组学的EGFR阳性鼻咽癌伴肺转移靶向治疗效果的早期精准预测模型构建”（项目编号：202102020711）；

作者贡献声明

彭成：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，监督，软件使用，实验设计，数据分析。林天海：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，软件使用，资源获取，实验设计，资金申请，数据管理。刘峰：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，监督，软件使用，项目管理，方法设计，数据分析。李文西：撰写 – 审稿与编辑，撰写 –

利益冲突

无

致谢

感谢广州第一人民医院老年病科的杨崇哲博士在手稿编辑和修订方面的帮助。

发表同意

不适用

临床试验编号

不适用

作者贡献

WL、GL、SH、TL、CP和FL共同设计了原始手稿，进行了实验并撰写了最终版本的手稿，同时管理和协调了整个研究项目。所有作者均已阅读并同意发表的手稿内容。

作者协议声明

• 我们声明本手稿为原创作品，