《Tissue and Cell》：Construction of Icariin-Loaded Bone Powder/PLA Composite Scaffold and Its Effect on Osteogenic Differentiation of hADSCs
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骨缺损修复中基于Icariin的PLA/骨粉复合支架促进hADSCs成骨分化研究。通过2D培养确定10-7M为最佳诱导浓度，复合支架孔隙率达91.52%，细胞活力超90%，证实Icariin可调控hADSCs向成骨方向分化，为传统中药在骨组织工程应用提供新思路。
郭伟婷 | 刘新月 | 刘英超 | 朱静静 | 何朗宇 | 唐艺然 | 程元益 | 李向琴 | 李丽楠 | 王宏飞 | 宋克东
大连工业大学癌症医院，精细化学品国家重点实验室，大连干细胞与组织工程研发中心，中国大连116024
摘要
由创伤、感染和肿瘤引起的骨骼缺陷和不愈合仍然是主要的临床挑战。目前，受仿生设计启发的“种子细胞 + 生长因子 + 生物材料”组织工程技术为功能性骨骼再生提供了有希望的途径。艾卡林（ICA）是一种从传统中药中提取的生物活性化合物，具有成本效益高、稳定性好、耐灭菌等优点，并已被证明能促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。尽管艾卡林已在骨骼组织工程中得到初步应用，但其对人类脂肪来源的间充质干细胞（hADSCs）的成骨诱导作用仍不明确。本研究在二维培养系统中评估了艾卡林对从人类脂肪组织中分离出的hADSCs的影响，发现其最佳成骨诱导浓度为10^-7 M。基于艾卡林与脱脂脱蛋白骨粉和聚乳酸（PLA）制备的骨骼组织工程支架，并接种了第五代hADSCs。结果表明，所有负载艾卡林的支架孔隙率均超过85%，与骨粉/PLA支架（91.52%）相比没有显著差异。此外，含有10^-7 M艾卡林的ICA-DDBP支架的细胞存活率超过90%。这些发现表明，将艾卡林结合到支架中可以在体内逐渐释放，从而促进hADSCs的成骨分化，突显了传统中药在骨骼组织工程中的新应用潜力。
引言
由创伤、感染或肿瘤引起的骨骼缺陷和不愈合仍然是全球主要的临床挑战，并导致巨大的经济损失（Graham等人，2025年；Metssemakers等人，2024年；Xue等人，2022年）。目前，自体骨移植受到供体部位并发症和骨量不足的限制（Laubach等人，2024年；Busch等人，2020年）。而异体骨移植则存在免疫排斥和感染的风险（Robertson等人，2024年；Urie等人，2024年；Migliorini等人，2022年），这大大降低了临床骨修复的有效性和适用性。
近年来，随着材料科学和组织工程的进步，许多研究探索了组织工程技术在骨修复中的应用（Rahaman和Mukherjee，2025年；Yuan等人，2024年；Fu等人，2022年；Rial等人，2021年）。研究主要集中在四个方面：种子细胞的探索（Hu等人，2024a；Bai等人，2022年；Sharma等人，2019年；Olson等人，2011年）；作为细胞外基质替代物的生物支架的开发（Wang等人，2025年；Tupe等人，2024年；Huang等人，2024年；Zhang等人，2020a）；体外构建工程骨组织（Hu等人，2024b；Zhang等人，2019年；Turnbull等人，2017年）；以及这些体外构建的临床应用（Hou等人，2016年）。早期的方法是将种子细胞接种到特定的支架材料上，然后进行体外培养，再移植到体内以修复受损组织。然而，这一过程劳动密集且耗时，特别不适合急性损伤的修复。考虑到骨组织相对简单的组成，将调节细胞增殖、诱导分化和促进生长的生长因子（?uczak等人，2024年）与生物材料结合使用，不仅可以克服生长因子的体内半衰期短和不稳定性（Pei等人，2023年），还可以延长其生物活性和靶点效应（Chen等人，2018年；Niu等人，2009年）。这种“种子细胞 + 生长因子 + 生物材料”的方法，受仿生设计的指导，为骨骼缺陷的功能性重建提供了有希望的策略（Kalaiselvan等人，2024年；Ferraz，2024年；Feng等人，2023年；Chen等人，2022年；Raina等人，2020年）。
艾卡林（ICA）是从传统中药淫羊藿中提取的主要生物活性成分，属于黄酮醇苷类化合物（Ramesh等人，2021年；Liu等人，2010年）。它具有高安全性、稳定的理化性质、低成本以及多种生物活性，包括促进成骨细胞增殖和分化同时抑制破骨细胞活性（Zhang等人，2024年；Wu等人，2024年；Zhang等人，2017年）。在骨骼组织工程中，艾卡林被用作生长因子的替代品，从支架中持续释放，以诱导种子细胞的定向成骨分化，并与其他生物材料结合构建功能性骨修复支架（Mohammadzadeh等人，2024年）。研究表明，10^-6 M的艾卡林浓度可以刺激骨髓间充质干细胞的增殖和分化（Ji等人，2025年；Jiao等人，2022年；Fan等人，2011年；Jiao等人，2018年），而高于10^-5 M的浓度可能会表现出细胞毒性，这取决于所测试的细胞种类（Liu等人，2019年）。
聚乳酸（PLA）是一种可生物降解的脂肪族聚酯，具有优异的生物相容性和可调的降解性能，已获得FDA的医疗应用批准（Nofar等人，2019年；Zende等人，2025年；Castro-Aguirre等人，2016年）。研究表明，多孔聚乳酸（PLA）基支架即使在高孔隙率（>80%）下也能保持良好的机械性能，压缩强度和弹性模量分别为8.22 ± 0.16 MPa和244.3 ± 5.7 MPa（Zhou等人，2025年）。这些结果表明，尽管支架具有多孔结构，但仍能保持优异的结构稳定性和承载能力，为骨缺陷修复提供了必要的初始机械支持。这些特性表明，基于PLA的支架能够为骨缺陷修复提供必要的初始机械支持。由于这些机械优势，PLA在骨骼组织工程领域显示出巨大潜力。然而，PLA表面的内在疏水性和缺乏生物活性功能基团限制了细胞的识别、粘附和成骨诱导能力，从而限制了其进一步的生物医学应用（Alavi等人，2023年；Xu等人，2022a；Promnil等人，2022年）。最近的研究通过将其与羟基磷灰石、壳聚糖等材料混合，改善了PLA的性能，增强了骨传导性、促进了细胞粘附和增殖，并实现了生长因子的可控释放，以促进新骨的形成（Li等人，2023年；Jia等人，2023年）。
骨粉来源于生物骨，主要由羟基磷灰石组成（Zhao等人，2025a），具有优异的生物相容性和骨传导性，可以引导骨生长并与宿主组织整合（Zhao等人，2025a；Li等人，2022年；Gruskin等人，2012年；Hu等人，2018年；Veremeev等人，2020年）。然而，其临床应用受到制造挑战和术后不稳定性的限制。
本研究开发了一种基于艾卡林与脱脂脱蛋白骨粉和PLA结合的生物活性骨骼组织工程支架，以促进骨修复和再生。首先从脂肪组织中分离并培养人类脂肪来源的干细胞（hADSCs），并验证了其出色的多向分化潜力。随后，使用材料复合技术制备了DDBP和ICA-DDBP复合支架，并对hADSCs进行了体外培养。实验结果表明，该支架具有明确的孔隙结构和良好的细胞粘附性，支持细胞增殖和生长。此外，ICA-DDBP支架通过持续释放艾卡林有效促进了hADSCs的成骨分化。总体而言，该支架系统为细胞生长和组织再生提供了适宜的微环境，在骨修复和再生方面显示出巨大潜力。
新鲜猪骨从当地市场购买；艾卡林（标准物质）从国家食品药品监督管理局（北京，中国）购买。胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、胶原酶和胰酶制剂从Gibco（美国）购买。高葡萄糖DMEM培养基、地塞米松、β-甘油磷酸二钠盐、胰岛素、转铁蛋白、亚油酸、抗坏血酸、TGF-β1、甲酚蓝、油红O和KH2PO4从Sigma-Aldrich（美国）购买。
原代hADSCs在24小时内贴壁，并最初表现出短梭形形态，核质比相对较高。到第5天，细胞逐渐延长为长梭形，到第10天，细胞数量显著增加，并观察到部分融合。在第5代传代时，增殖加速，显示出典型的漩涡状排列，大多数不规则细胞消失，表明纯度提高（图1A）。
本研究开发并验证了一种ICA骨粉/PLA复合支架，并系统评估了其在
体外对hADSCs的成骨效应。使用从人类脂肪组织中分离出的第五代hADSCs作为种子细胞，这些细胞具有典型的形态、高存活率和多向分化潜力。
体外结果显示，10^-9至10^-6 M范围内的艾卡林没有明显的细胞毒性，细胞存活率始终高于93%。值得注意的是，10^-7 M的艾卡林...
郭伟婷 & 刘新月 & 刘英超：方法学、数据管理、正式分析、研究、可视化、软件、撰写-初稿。朱静静：方法学、撰写-审稿与编辑。何朗宇 & 唐艺然：正式分析、数据管理。程元益：监督、撰写-审稿与编辑。李向琴 & 李丽楠 & 王宏飞：方法学、资源获取、监督、撰写-审稿与编辑。宋克东：概念化、方法学、资金获取、项目规划
本研究得到了中央高校基本研究经费（DUT25YG106）、大连民族大学生物技术与生物资源利用重点实验室开放基金、教育部（KF2025007）、国家自然科学基金（31670978）、傅荣东教育基金会（132027）、精细化学品国家重点实验室（KF1111）以及传统中药创新药物工程研究中心基金的支持。
李向琴：撰写-审稿与编辑、监督、资源管理、方法学。
王宏飞：撰写-审稿与编辑、可视化、资源管理、方法学。
李丽楠：撰写-审稿与编辑、监督、资源管理、方法学。
郭伟婷：撰写-审稿与编辑、撰写-初稿、可视化、软件、方法学、研究、正式分析、数据管理。
宋克东：撰写-审稿与编辑、撰写-初稿、可视化、验证、监督
