紫素在促进人牙髓干细胞向牙源性细胞分化中的作用及其分子机制

《Tissue and Cell》：The role and molecular mechanism of Shikonin in promoting odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells

紫草素促进hDPSCs成牙分化及MAPK通路机制研究。

　　

张晓月|龚玲玲|赵青|黄子轩|乐曼妮|张慧琳|王晓聪|李明|张书生

中国湖南省长沙市长沙口腔医院，邮编410004

摘要

背景

在组织工程应用中，人类牙髓干细胞（hDPSCs）是一种理想的生物资源，因为它们可以通过牙源性分化来再生牙髓-牙本质复合体。从红根蓝莓根中提取的红色紫色萘醌化合物——紫堇素（SHI）在这方面显示出潜力。然而，关于SHI促进hDPSCs牙源性分化的综合研究仍然有限。本研究旨在探讨SHI对hDPSCs牙源性分化的影响，并探索其背后的机制。

材料与方法

体外实验使用了细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测、碱性磷酸酶（ALP）/阿利扎林红S（ARS）染色、ALP活性测定、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot分析。体内实验中，将装载有hDPSCs的皮下支架植入裸鼠的背部，随后进行组织学和免疫组化分析。

结果

结果显示，浓度高达0.5 μM的SHI并未显著影响hDPSCs的增殖。然而，在0.25 μM的浓度下，SHI促进了hDPSCs的牙源性分化。相应地，体内实验表明SHI增强了hDPSCs形成的矿化基质。此外，抑制MAPK通路可以阻断SHI诱导的hDPSCs牙源性分化标志物的上调。

结论

这些发现表明，SHI可能通过激活MAPK信号通路来促进hDPSCs的牙源性分化，为牙髓-牙本质再生新策略的探索提供了依据。

引言

不可逆的牙髓炎或牙髓坏死可能由多种因素引起，包括深龋洞、深牙周袋、意外创伤等（Peters等人，2024年）。目前，根管治疗是首选的治疗方法。然而，牙髓丧失会损害牙齿的免疫保护和感觉功能，从而增加牙齿断裂的风险（Monsef等人，2024年）。通过干细胞、生长因子和支架的最佳组合来恢复牙齿生理功能的牙髓再生领域，受到了组织工程和再生医学进展的显著影响（Gong等人，2016年）。

人类牙髓干细胞（hDPSCs）最初由Gronthos等人（2000年）从第三磨牙中分离出来。这些细胞因具有多种优势而成为组织工程的理想候选者。首先，它们易于获取，来源于常见的来源，并且采集简单。其次，hDPSCs具有较低的免疫原性，不会引发重大的伦理问题。此外，它们具有出色的增殖能力、自我更新能力以及多向分化的潜力（Stefańska等人，2024年）。由于其组织特异性，hDPSCs在体外诱导矿化后容易发生牙源性分化（Morsczeck和Reichert，2018年）。临床前研究表明，无论是皮下还是原位干预都可以生成具有类似正常牙髓结构特征的牙髓样组织（Liang等人，2022年；Xuan等人，2018年；Zhu等人，2018年）。此外，专注于牙髓再生的临床试验已经产生了包含牙本质形成层、结缔组织、血管甚至神经元标志物的三维完整牙髓组织（Stefańska等人，2024年）。值得注意的是，再生的牙髓表现出正常的功能，支持牙齿的持续发育（Feitosa等人，2021年；Meza等人，2019年；Nakashima等人，2017年）。这项研究不仅为使用hDPSCs形成牙髓-牙本质复合体奠定了坚实的理论基础，还强调了它们在牙髓再生临床应用中的巨大潜力。

在治疗疾病方面的天然疗法研究取得了显著进展，例如从传统中药中提取的青蒿素等化合物的创新应用（Ma等人，2020年）。其中一种化合物是紫堇素（SHI），它是一种从红根蓝莓根中提取的小分子提取物。SHI表现出抗炎、抗癌、免疫调节和抗菌作用（Sun等人，2022年）。同时，SHI在老年小鼠模型中显示出强大的成骨和促血管生成特性，有效改善了与年龄相关的骨质退化（Hu等人，2025年）。

hDPSCs向牙源性谱系的分化不仅受小分子化合物的调控，还受到复杂的细胞信号网络以及细胞与细胞外基质（ECM）之间动态相互作用的调控（Kornsuthisopon等人，2025年）。先前的研究表明，SHI通过MAPK信号通路促进骨髓来源的间充质干细胞的成骨分化，并通过AKT-mTOR信号通路在体外诱导hDPSCs的牙源性分化（Kajiura等人，2021年；Lin等人，2023年）。鉴于其良好的生物相容性、明确的牙源性潜力、易获取性和低成本，进一步研究SHI是否具有多靶点调控作用以及在体内促进矿化基质形成的能力是值得的。目前尚不清楚MAPK信号通路是否参与SHI诱导的hDPSCs牙源性分化。

因此，本研究首先通过体外实验探讨了SHI对hDPSCs增殖和牙源性分化标志物表达的影响，以阐明其生物学效应。随后，使用特定抑制剂功能验证了MAPK通路的作用，从而揭示了SHI调控的新机制维度。此外，还利用裸鼠异位移植模型评估了SHI在体内促进矿化基质形成的能力。最终，这项研究旨在为SHI在牙髓再生中的临床应用建立坚实的理论基础。

部分内容摘录

hDPSCs的分离与培养

本研究得到了长沙口腔医院的批准（许可编号：CSH-2020–04），所有参与者均签署了知情同意书。所有实验均按照批准的方案进行。2021年，我们从18-24岁无龋齿的患者中获取了健康的牙髓组织。原始hDPSCs被提取并在通用培养基（GM）中培养，该培养基包含1%的青霉素/链霉素和10%的胎牛血清（所有试剂均购买自……）

hDPSCs的分离与鉴定

hDPSCs的形态与成纤维细胞相似（图1A）。通过多方向分化实验，我们成功诱导这些细胞分化为成骨细胞和脂肪细胞谱系（图1B和1C）。流式细胞术分析显示，这些细胞对CD34和CD45呈阴性，而对CD44、CD90和CD105呈阳性，阳性细胞的比例分别为98.45%、97.62%和99.95%（图1D）。这些实验结果证实了hDPSCs的这些特征

讨论

目前，各种再生性根管治疗，如牙髓覆盖、部分牙髓切除和根管再血管化，已被证明可以有效保持或恢复牙齿活力（Murray，2023年）。在这些治疗方法中，基于干细胞的方法尤其具有前景，因为它们有望在高度有序的生理模型中重建原始牙髓的复杂组织结构（Su等人，2025年）。此外，临床前和临床研究也表明……

作者声明

我们声明本手稿是原创的，尚未在其他地方发表，也没有被其他出版机构考虑发表。我们确认该手稿已经过所有列出的作者审阅和批准，且没有遗漏符合作者资格的人选。手稿中作者的排序已得到所有人的同意。

我们理解通讯作者在整个编辑过程中是唯一的联系人。

CRediT作者贡献声明

张晓月：写作——审阅与编辑、初稿撰写、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构思。张书生：写作——审阅与编辑、数据可视化、验证、项目监督、资金筹集、数据管理。黄子轩：初稿撰写、软件使用、资源准备、方法学设计、实验设计、数据管理。乐曼妮：初稿撰写、软件使用、资源准备、方法学设计、实验设计、数据管理。

资助

本工作得到了湖南省科学技术厅的支持（资助编号：2020SK2137）。