微/纳塑料通过激活NF-κB信号通路诱导甲状腺滤泡细胞焦亡并触发甲状腺毒性的机制研究

《Annals of Medicine》：Micro/nanoplastics induce thyroid follicular cell pyroptosis to trigger thyrotoxicity by activating NF-κB signaling

本研究系统揭示了环境中广泛存在的微/纳塑料(MNP)暴露诱导甲状腺毒性的新机制。研究证实，MNP，尤其是纳米塑料(NP)，能通过激活核因子-κB(NF-κB)信号通路，驱动甲状腺滤泡细胞发生NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体介导的程序性炎症性细胞死亡（焦亡，pyroptosis），从而破坏甲状腺结构和内分泌功能（表现为血清游离甲状腺素(fT4)、游离三碘甲状腺原氨酸(fT3)降低及促甲状腺激素(TSH)代偿性升高），为理解塑料污染对内分泌系统的健康风险提供了关键的分子病理学证据。

　　

引言

全球塑料产量的激增及其在环境中的持续积累，已使微塑料(MP，直径1 μm-5 mm)和纳米塑料(NP，直径<1 μm)成为普遍存在的污染物。它们可通过多种途径，尤其是经口摄入，在生物体内蓄积并穿越关键生物屏障，进入循环系统，从而对包括甲状腺在内的多个器官系统构成潜在的健康风险。甲状腺作为最大的内分泌器官，通过分泌甲状腺激素（主要是甲状腺素(T₄)和三碘甲状腺原氨酸(T₃)）来调节新陈代谢、生长和发育，其功能的精确调控依赖于下丘脑-垂体-甲状腺轴的反馈机制。由于甲状腺血供丰富，使其特别容易受到血液中环境污染物（如MNP）的影响。然而，MNP诱导甲状腺毒性的具体分子机制仍不明确。焦亡是一种由NLRP3炎性小体激活介导的炎症性程序性细胞死亡，其典型特征是半胱天冬酶-1(CASPASE1)被激活，进而切割gasdermin-D(GSDMD)蛋白形成质膜孔，并促进促炎细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)的成熟与释放，最终导致细胞裂解。核因子-κB(NF-κB)信号通路作为关键的炎症调节因子，已被证实参与环境应激源诱导的甲状腺细胞焦亡过程。本研究旨在探究环境相关浓度的MNP暴露是否通过NF-κB信号通路诱导甲状腺滤泡细胞焦亡，从而加剧甲状腺损伤。

材料与方法

本研究使用4周龄的雄性C57BL/6小鼠，随机分为三组：对照组（生理盐水）、微塑料组(MP，5 μm直径)和纳米塑料组(NP，50 nm直径)。MNP通过灌胃给药，剂量为30 mg/kg体重，每周五次，持续暴露4周和8周。实验评估了血清甲状腺激素水平（采用ELISA试剂盒检测游离T₃(fT₃)、游离T₄(fT₄)和促甲状腺激素(TSH)）、甲状腺组织学结构（通过苏木精-伊红(HE)和过碘酸希夫(PAS)染色），并通过免疫荧光(IF)分析检测了凋亡指标（BCL2、BAX、CASPASE3）、炎症因子（IL-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)）、焦亡相关蛋白（NLRP3、CASPASE1和GSDMD）以及NF-κB信号通路活性（NF-κB及其磷酸化形式p-NF-κB）。DNA断裂凋亡通过TUNEL染色检测。所有数据分析均使用GraphPad Prism 8软件进行。

结果

MNP暴露引起小鼠系统性毒性及甲状腺结构与功能破坏

经过8周的MNP暴露后，MP和NP处理均导致小鼠体重显著下降。更为重要的是，MNP暴露严重破坏了甲状腺激素稳态。与对照组相比，MP和NP处理均显著降低了血清fT₄水平，其中NP的降低幅度（降至对照的20.8%）远大于MP（降至对照的67.5%）。fT₃水平在NP处理组也显著降低。作为代偿反应，两组的血清TSH水平均显著升高。这些结果表明NP比MP表现出更强的甲状腺抑制效应，具有颗粒尺寸依赖性。组织学评估显示，对照组的甲状腺滤泡形态规整、结构完好。而MP和NP暴露均诱导了显著的形态学恶化：滤泡直径和滤泡上皮细胞厚度显著减小，同时单位面积内的滤泡数量（密度）显著增加，提示滤泡破碎和代偿性增生。NP暴露还导致了更严重的组织结构破坏，包括广泛的滤泡变形、明显的胶质空泡化、组织塌陷以及广泛的炎性细胞浸润。组织病理学评分证实了NP组比MP组损伤更严重。

MNP暴露诱导甲状腺滤泡细胞凋亡

为了探究观察到的结构损伤是否与细胞死亡有关，研究检测了凋亡相关蛋白的表达。免疫荧光分析显示，MNP暴露显著扰乱了促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白BCL-2之间的平衡，导致BAX/BCL-2比值随时间显著增加，反映了细胞凋亡易感性增强。凋亡执行蛋白CASPASE3的表达在两组中均显著上调。其中，NP暴露在8周时诱导了更持续和进行性的CASPASE3激活（升高至对照的11.8倍）。TUNEL染色进一步证实了DNA断裂凋亡的发生。在暴露4周时，NP组的TUNEL阳性细胞比例（11.2%）高于MP组（7.0%）；至8周时，两组的凋亡细胞比例趋于相近（约10%），表明长期暴露造成了类似的慢性凋亡负担。

MNP暴露刺激甲状腺组织炎症浸润

研究检测了关键促炎细胞因子在甲状腺滤泡细胞中的表达。MNP干预显著增强了IL-1β、IL-18和TNF-α的表达，并显示出不同的时间模式和颗粒尺寸依赖模式。IL-1β的反应最为剧烈，在4周时MP和NP组分别升高了27.5倍和42.7倍。IL-18和TNF-α的表达也显著上调，且NP处理通常诱导更强的效应。有趣的是，血清IL-1β分析显示，NP暴露导致循环IL-1β水平升高了3.0倍，而MP处理却使其降低至对照的57.4%，提示颗粒尺寸对局部与全身炎症反应的影响存在差异。

MNP暴露导致甲状腺细胞焦亡

鉴于IL-1β和IL-18的大量产生是焦亡的典型特征，研究进一步检测了焦亡关键介质。结果显示，MP和NP暴露均显著上调了所有三个焦亡标志物（NLRP3、CASPASE1和GSDMD）的表达，且NP consistently诱导更强的反应。代表NLRP3炎性小体成功组装的NLRP3⁺ASC⁺细胞百分比持续升高。CASPASE1作为焦亡的中心执行者，在两组中均被强烈激活。GSDMD作为焦亡性细胞死亡的终末效应蛋白，也表现出时间依赖性的增加。这些发现表明，MNP暴露主要通过激活甲状腺滤泡细胞中NLRP3介导的焦亡来刺激过量炎性细胞因子的产生。

MNP暴露激活甲状腺滤泡细胞中的NF-κB信号通路

为阐明MNP诱导炎症和焦亡反应的潜在上游机制，研究检测了NF-κB信号通路的激活情况。在暴露4周后，MP和NP均显著增加了总NF-κB及其磷酸化形式p-NF-κB的表达，其中NP组的激活水平 consistently高于MP组。这表明MNP暴露以颗粒尺寸依赖的方式激活了甲状腺滤泡细胞中的NF-κB信号通路，为MNP暴露与后续观察到的炎症、焦亡和凋亡反应之间提供了机制联系。NF-κB的增强激活被认为是转录增强NLRP3表达的经典上游信号通路，可能诱导焦亡的启动。

讨论

本研究揭示了MNP暴露通过激活NF-κB/NLRP3/焦亡轴诱导甲状腺毒性的新机制。研究所用的30 mg/kg剂量落在人类可能暴露的估算范围内，具有环境相关性。NP表现出比MP更强的毒性，这与纳米颗粒更高的生物利用度、更优的跨膜穿透能力以及在甲状腺滤泡细胞中优先蓄积的特性有关。观察到的甲状腺激素紊乱（fT₄、fT₃降低，TSH升高）与甲状腺结构损伤（滤泡直径减小、上皮变薄、密度增加）相吻合，为功能失调提供了形态学基础。剧烈的炎症反应，特别是IL-1β、IL-18和TNF-α的浸润，与滤泡结构的破坏同时发生。尤为重要的是，研究发现焦亡（而非凋亡）是MNP诱导甲状腺细胞死亡的主要形式，其相关蛋白的上调幅度（数百倍）远超凋亡标志物。焦亡固有的炎症特性会促进细胞因子释放，形成恶性循环。NF-κB信号通路的显著激活为上游调控事件提供了关键线索。本研究也存在一些局限性，例如仅使用了雄性小鼠、单一暴露剂量、未量化甲状腺组织中的MNP浓度、未进行功能性抑制实验验证因果关系、未全面评估下丘脑-垂体-甲状腺轴功能以及未探讨毒性是否可逆等。未来研究需要涵盖两性、建立剂量-反应关系、结合功能实验并探索其他细胞通路（如氧化应激、自噬）的作用。

结论

总而言之，本研究发现MNP暴露通过破坏甲状腺结构和内分泌功能发挥甲状腺毒性作用。具体而言，MP和NP通过激活NF-κB信号通路，促进NLRP3介导的滤泡细胞焦亡，其中NP展现出比MP更强的毒理学效力。这些发现确立了焦亡作为塑料颗粒诱导内分泌干扰的一个重要潜在机制，为环境塑料毒理学提供了新见解，并凸显了对纳米级塑料颗粒进行全面暴露风险评估的迫切性。