《Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology》：Preliminary genipin-crosslinked gelatin–asiaticoside injectable hydrogel for future biomaterials ink: physicochemical properties and cytocompatibility for wound repair
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本文综述了一种新型生物材料墨水的开发与应用前景，该墨水以明胶(Gelatin)为基质，使用天然交联剂京尼平(Genipin)交联，并负载了具有促愈合活性的积雪草苷(Asiaticoside, ASI)。研究系统评估了该可注射水凝胶的溶胀率、水蒸气透过率(WVTR)、接触角、孔隙率、酶降解、表面粗糙度、机械性能及细胞毒性。结果表明，负载ASI显著增强了水凝胶的亲水性、改善了溶胀行为，并保持了优异的生物可降解性与结构稳定性，WVTR值位于伤口愈合的理想范围(1500–2500 g/m2h)。体外细胞实验证实其具有良好的细胞相容性，可支持人真皮成纤维细胞(HDFs)的生长与迁移，初步的3D生物打印(3D-bioprinting)评估也显示了其作为生物材料墨水的应用潜力。该研究为慢性伤口愈合及组织工程领域提供了一种兼具生物活性和良好打印性的新型候选材料。
慢性伤口，尤其是与糖尿病、肥胖或血管疾病相关的伤口，其愈合延迟和高感染风险构成了重大的医疗负担。传统疗法效果有限，而组织工程，特别是三维生物打印(3D-bioprinting)，为制造模拟细胞外基质(ECM)的定制化支架提供了新途径。生物材料墨水作为3D打印的关键组分，需平衡可注射性、机械稳定性、降解行为与生物活性。本研究旨在开发一种用于伤口愈合的新型生物材料墨水，其核心是明胶(Gelatin)、天然交联剂京尼平(Genipin, GNP)与生物活性成分积雪草苷(Asiaticoside, ASI)的协同组合。
研究设计
研究在马来西亚国民大学伦理委员会批准下进行。使用了两种明胶浓度(9% w/v和10% w/v)制备水凝胶，并负载0.05% w/v的ASI。ASI的浓度通过剂量反应测试确定，该浓度在促进细胞增殖的同时保持低细胞毒性。水凝胶通过京尼平交联，并使用3D生物打印机评估其挤出打印性能。
积雪草苷对人真皮成纤维细胞的影响
MTT细胞毒性实验显示，ASI在较低浓度(0.01%至0.1% w/v)下能维持甚至促进人真皮成纤维细胞(HDFs)的活力，但在较高浓度(0.5%和1.0% w/v)下表现出明显的细胞毒性。因此，选择0.05% w/v作为水凝胶负载的安全有效浓度。
水凝胶的外观、胶凝时间与可打印性
负载ASI的水凝胶呈浅蓝色至蓝绿色凝胶状，具有半透明外观。ASI的加入(0.05% w/v)显著加速了水凝胶的胶凝过程。通过挤出和3D打印评估发现，ASI的掺入改善了墨水的挤出均匀性和打印保真度。与未负载ASI的9GE水凝胶相比，9GE_0.05ASI打印出的丝线宽度分布更窄、更均匀，变异系数(CV%)更低，表明ASI提高了打印的精度和一致性。
物理特性分析
对水凝胶的溶胀率、接触角、水蒸气透过率(WVTR)和生物降解率进行了系统评估。
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溶胀行为：所有水凝胶均表现出高溶胀能力(>500%)，ASI的加入进一步显著提升了溶胀率，9GE_0.05ASI的溶胀率最高(954.8 ± 96.3%)，表明其优异的渗出液管理潜力。
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表面亲水性：所有水凝胶接触角均低于90°，显示亲水性。ASI的加入显著降低了10GE水凝胶的接触角，增强了表面亲水性，有利于细胞粘附。
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水蒸气透过性：所有配方的WVTR值均处于理想的伤口愈合范围(>1500 g/m2h-1)。虽然ASI的加入使9GE的WVTR有所降低，但仍处于适宜区间，有助于维持伤口床的湿润环境。
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生物降解：所有水凝胶在胶原酶溶液中的降解速率均低于0.1 mg/h，表明其具有可控的、缓慢的降解特性，适合为伤口愈合提供持续支持。
机械性能与流变学表征
压缩和回弹性测试表明，所有水凝胶配方均能承受约300g重量并显示出高压缩强度和近乎完全的形状恢复能力，ASI的加入未显著改变其基本机械性能。流变学分析显示，负载ASI的水凝胶(9GE_0.05ASI)比未负载的(9GE)具有更低的复数粘度、储能模量(G′)和损耗模量(G″)，表明ASI的加入使凝胶网络结构略微疏松，这可能改善了其在复杂伤口形状中的适形性和可注射性。
化学表征
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傅里叶变换红外光谱(FTIR)：光谱显示，明胶与京尼平交联后，酰胺I带和酰胺II带发生位移，证实了席夫碱(C=N)等交联键的形成。ASI负载的水凝胶在1030-1080 cm-1区域出现C-O伸缩振动特征峰，表明ASI被成功物理包载于水凝胶网络中。
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X射线衍射(XRD)：所有水凝胶均在2θ≈20°处显示宽衍射峰，表明主要为无定形结构伴部分结晶区域。9GE_0.05ASI的结晶度百分比最高(48.13%)，表明ASI在较低明胶浓度下有助于增强分子有序性。
三维微观多孔结构
扫描电子显微镜(SEM)图像显示，水凝胶具有多孔结构。ASI的加入显著细化了孔结构，降低了平均孔径(如9GE从221±75 μm降至67±18 μm)和孔隙率。原子力显微镜(AFM)表面形貌分析表明，ASI的加入显著降低了水凝胶的表面粗糙度(Ra值)，形成了更光滑、更均匀的表面，这可能有利于细胞响应。
细胞毒性评估与三维生物打印
使用活/死细胞染色试剂盒评估水凝胶对人真皮成纤维细胞的细胞毒性。培养24小时后，9GE和9GE_0.05ASI水凝胶上仅观察到极少量死细胞(红色染色)，细胞活性均接近100%，证明其优异的生物相容性和低细胞毒性。
细胞迁移评估(划痕实验)
通过划痕愈合实验评估ASI对HDFs迁移的影响。结果显示，与未负载ASI的9GE水凝胶浸提液相比，9GE_0.05ASI浸提液处理的细胞在划痕后第3天显示出显著加速的伤口闭合率。到第5天，两组均实现完全或接近完全闭合。定量分析证实，ASI的加入对愈合进程有显著的促进作用。
讨论
本研究成功开发了京尼平交联的明胶-积雪草苷可注射水凝胶。ASI在0.05% w/v浓度下被证明是安全且有效的，既能促进成纤维细胞活性，又能调节水凝胶的理化性质(如加速胶凝、增强亲水性和溶胀性)。该水凝胶展现出适合伤口敷料的理想特性：高溶胀性以吸收渗出液、适宜的WVTR以保持湿润环境、可控的降解速率以提供临时支撑、良好的机械弹性和回弹性以贴合伤口。特别是，其改善的亲水性和更光滑的表面可能更利于细胞附着。流变学性能和初步的3D打印结果表明，该配方具有作为生物材料墨水的潜力，可用于构建复杂的组织工程支架。综合来看，这种结合了明胶的生物相容性、京尼平交联的机械稳定性以及ASI多重生物活性的复合水凝胶，为慢性伤口治疗和未来个性化3D生物打印应用提供了一种有前景的新型多功能材料平台。
