《Bioanalysis》：A simple and highly sensitive LC-MS/MS bioanalytical method for phosphorodiamidate morpholino oligonucleotides in plasma
引言背景
近年来，反义寡核苷酸（ASO）已进入临床试验阶段并获批。ASO具有高分子量、高亲水性和低膜渗透性等独特的理化性质。其药代动力学特征与小分子药物大不相同，包括口服吸收差、血浆消除快以及在肾脏蓄积。临床使用的ASO按其化学结构主要分为两类：硫代磷酸酯ASO（PS-ASO）和磷酰二胺吗啉代寡聚物（PMO）。PS-ASO和PMO之间最显著的理化性质差异在于电荷：PS-ASO带负电荷，而PMO呈电中性。在药代动力学特征方面，主要差异在于蛋白质结合和代谢。PS-ASO表现出高血浆蛋白结合率，而PMO的血浆蛋白结合率较低。PS-ASO在一定程度上可被核酸酶代谢，而PMO则相当稳定。由于蛋白结合率低导致肾小球滤过率高，PMO从血浆中消除的速度比PS-ASO更快，这使得在消除阶段准确量化PMO变得困难。为了评估PMO的这些药代动力学特性，开发稳健且高灵敏度的生物分析方法至关重要。
用于定量ASO的生物分析方法有多种，其中高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）是最常用的方法之一。LC-MS/MS与其他生物分析方法相比具有多种优势，如动态范围宽、特异性高，以及具有鉴定和定量截短代谢物的潜力。在基于LC-MS/MS的生物分析中，液相色谱条件是重要因素。ASO生物分析中最常用的液相色谱方法是离子对反相液相色谱（IP-RPLC）。离子对试剂可以提高灵敏度和HPLC分离度。然而，在LC-MS/MS分析中使用离子对试剂有几个缺点，如重现性差、色谱柱耐用性降低、以及难以从系统中彻底清除离子对试剂，这需要专门的仪器或耗时冗长的系统清洗。因此，有许多关于使用无离子对的LC-MS/MS对ASO进行定量生物分析方法的报道。其中最常用的是亲水相互作用色谱（HILIC），该方法曾用于维特拉生的生物分析。然而，HILIC也存在一些问题，例如平衡时间长和重现性差。最近，已有使用无离子对反相液相色谱（RPLC）进行PS-ASO和小干扰RNA（siRNA）LC-MS/MS分析的报道。该方法有望克服IP-RPLC和HILIC的缺点。
在使用LC-MS/MS对ASO进行生物分析时，样品前处理步骤也同样重要，因为需要去除基质组分。固相萃取（SPE）、蛋白质沉淀（PPT）和液液萃取（LLE）是药物开发中生物分析的主要样品前处理方法。SPE是ASO样品前处理最常用的方法。为利用PS-ASO的负电荷，通常使用弱阴离子交换吸附剂或含离子对试剂的反相吸附剂。对于PMO，包括通过蛋白酶K/胰蛋白酶消化肽缀合PMO产生的PMO-Gly，已有使用含反相吸附剂的Oasis HLB 96孔板的报道。然而，使用SPE进行样品前处理一直存在障碍，例如回收率低、程序复杂和成本高。例如，多数报道中使用SPE处理PS-ASO的回收率低于80%。此外，在已获批PMO药物戈洛迪生（golodirsen）、维特拉生和卡西默生的临床试验生物分析方法中使用了SPE，但回收率分别较低，为34.8–41.8%、67.5–84.5%和25.2–41.4%。如此低的回收率可能会影响方法的稳健性。
本研究旨在采用优化的PPT来实现高回收率、高灵敏度和快速前处理，以期建立一种用于定量典型PMO维特拉生的新生物分析方法。此外，考虑到PPT前处理中潜在的基质效应问题，本研究评估了两种HPLC模式（HILIC和RPLC），试图避免基质效应。
材料与方法
化学品与生物材料
维特拉生（一种21碱基PMO，序列5′-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3′；分子量6924.82）由日本新药株式会社合成。用作内标（IS）的盐酸普萘洛尔购自富士胶片和光纯药株式会社。普萘洛尔作为内标的选择依据了先前的研究。ψM23D (+07–18)是一种靶向小鼠肌营养不良蛋白前mRNA第23外显子的PMO，同样由日本新药株式会社合成；它是一种具有PMO骨架的25碱基ASO（序列5′-TAAAGTCCATTCGGCTCCAAACCGG-3′；分子量8236.072）。乙腈（MeCN；HPLC级）购自富士胶片和光纯药株式会社。甲酸（FA；保证试剂）和甲醇（MeOH；保证试剂）购自Nacalai Tesque株式会社。水使用Elix Essential UV3和Milli-Q Advantage A10纯化系统制备。大鼠血浆由20只雄性斯普拉格-道利大鼠制备。所有动物实验程序均按照日本新药动物实验使用委员会的规定进行。人血浆购自BioIVT。
LC-MS/MS条件
LC-MS/MS分析使用Acquity premier UPLC系统与Xevo TQ-XS三重四极杆质谱仪联用。在RPLC中，使用ACQUITY UPLC CSH C18 130?, 1.7 μm, 2.1 mm × 50 mm色谱柱和ACQUITY Premier CSH C18 130?, 1.7 μm, 2.1 mm × 50 mm色谱柱进行色谱分离。柱温设为60°C。梯度洗脱使用流动相A（0.1% FA水溶液）和B（0.1% FA乙腈溶液），流速0.6 mL/min。梯度程序如下：0 min，A:B = 95:5 (v/v)；线性变化至1.5 min达到50:50，3.0 min达到5:95。为了冲洗出疏水性物质，在2.0至3.0 min期间流速增加到1.2 mL/min。总运行时间为4.0 min，自动进样器温度设为10°C。高浓度和低浓度范围的进样体积分别为4 μL和10 μL。
在HILIC中，使用Unison UK-Amino 130?, 3.0 μm, 3.0 mm × 150 mm色谱柱进行色谱分离。本研究使用的HILIC色谱柱不含任何特定的表面涂层或抗吸附处理。柱温设为60°C。梯度洗脱使用流动相A（0.1% FA水溶液）和B（0.1% FA乙腈溶液），流速0.6 mL/min。梯度程序如下：0 min，A:B = 50:50 (v/v)；1.5 min，100:0；1.6 min，100:0；3.0 min，50:50。总运行时间为5.0 min。自动进样器温度设为10°C，进样体积为4 μL。
采用正离子模式电喷雾电离和多反应监测（MRM），条件如下：源温150°C，毛细管电压2.5 kV，锥孔气流150 L/h，脱溶剂气温度600°C，脱溶剂气流1000 L/h。选择m/z 269.00 > 82.00、269.00 > 82.00和273.10 > 82.00的MRM转换分别用于定量维特拉生、ψM23D (+07–18)和普萘洛尔。相应的锥孔电压分别为35、50和33 V，碰撞能量分别为19、20和18 V。使用MassLynx 4.2软件处理原始LC-MS/MS数据，采用ApexTrack Peak算法。
校准标准品和质量控制样品的制备
将维特拉生和ψM23D (+07–18)的储备液分别用70%甲醇配制成1 mg/mL浓度。用70%甲醇稀释储备液以制备标准工作溶液（高浓度范围100至20000 ng/mL，低浓度范围10至2000 ng/mL）。为制备高浓度范围的校准标准品，将5 μL各标准工作溶液加入50 μL空白大鼠血浆中。对于低浓度范围，将10 μL各标准工作溶液加入100 μL空白大鼠血浆中。
质量控制（QC）工作溶液由储备液配制，浓度分别为100、200、5000和16000 ng/mL（高范围）以及10、20、500和1600 ng/mL（低范围）。为制备QC样品，将5 μL各标准工作溶液加入50 μL空白大鼠血浆中。对于低浓度范围，将10 μL各标准工作溶液加入100 μL空白大鼠血浆中。
样品前处理
对于高浓度范围，向校准标准品和QC样品中加入200 μL含100 ng/mL普萘洛尔的甲醇。涡旋混合后，样品在20°C下以18000 g离心5 min。取100 μL所得上清液转移至Multiscreen Solvinert 96孔过滤板的一个孔中，并加入100 μL水。移液混合后，将样品过滤到带350 μL孔板的96孔样品收集板中。获得的样品用于LC-MS/MS分析。
对于低浓度范围，向校准标准品和QC样品中加入400 μL含100 ng/mL普萘洛尔的甲醇。涡旋混合后，样品在20°C下以18000 g离心5 min。将全部体积的所得上清液转移至Multiscreen Solvinert 96孔过滤板的一个孔中。将样品过滤到DNA LoBind深孔板中，并用离心蒸发仪将过滤后的样品干燥。干燥的样品用150 μL 40%甲醇复溶，并转移到带350 μL孔板的96孔样品收集板中。获得的样品用于LC-MS/MS分析。
方法性能评估
为评估方法性能，对批内和批间准确度与精密度、线性、回收率、基质效应和残留进行了评估。
批内准确度与精密度
在四个浓度（LLOQ、低QC、中QC和高QC）下评估批内准确度和精密度，每个浓度n=5。校准标准品在同一批次中制备、处理和分析。从同一运行批次中的校准曲线确定分析物的血浆浓度。准确度和精密度分别使用公式1和2从五个测量值的平均值计算。
对于LLOQ，准确度应在100.0 ± 20.0%内，精密度应小于或等于20.0%。对于其他QC，准确度应在100.0 ± 15.0%内，精密度应小于或等于15.0%。
批间准确度与精密度
在四个浓度（LLOQ、低QC、中QC和高QC）下评估批间准确度和精密度，每个浓度n=5。校准标准品在同一批次中制备、处理和分析。从同一运行批次中的校准曲线确定分析物的血浆浓度。此操作在三个不同的日期各进行一次。准确度和精密度分别根据每个测量日（5个测量值，3天）的平均值和所有测量日合并（15个测量值）的平均值，使用公式1和2计算。验收标准与批内准确度和精密度相同。
回收率
通过比较PPT处理前（回收率样品）和处理后（标准样品）加入标准溶液的样品的峰面积比（分析物/内标）来计算回收率，计算公式为公式3。
基质效应
通过比较含有或不含基质的样品的峰面积比（分析物/内标）来计算基质因子，计算公式为公式4。不含基质的样品使用水代替大鼠血浆制备。
残留
在校准标准品定量上限（ULOQ）样品分析后，立即连续两次进样空白样品。空白样品以与校准标准品和QC样品相同的方式制备，不同之处是用水代替工作溶液，并使用不含普萘洛尔的甲醇进行PPT。此程序重复三次。作为验收标准，在全部三次分析运行中，ULOQ样品后第一个空白样品在分析物保留时间处的残留峰面积应小于或等于LLOQ处相应分析物峰面积的20.0%。对于内标，空白样品中内标保留时间处的残留峰面积应小于或等于LLOQ处相应内标峰面积的5.0%。
统计分析
使用Microsoft? Excel?进行双尾Student’s t检验评估数据的统计学显著性。p < 0.05表示有统计学显著性。
结果
通过蛋白质沉淀开发样品前处理方法
为了开发一种适用于血浆中维特拉生的简单且高回收率的样品前处理方法，研究了使用两种不同有机溶剂（乙腈和甲醇）的PPT方法。在低浓度（50 ng/mL）维特拉生的大鼠血浆中，使用乙腈和甲醇的回收率分别为60.3%和93.4%，因此甲醇的回收率比乙腈高出约1.5倍。在大鼠血浆中高浓度（1000 ng/mL）维特拉生中也观察到类似结果，回收率分别为58.5%和102%。相比之下，内标普萘洛尔在乙腈和甲醇中的回收率没有显著差异，分别为88.1%和87.5%。
通过修改液相色谱条件减少基质效应
为了减少PPT提取样品的基质效应，评估了两种HPLC模式：HILIC（Unison UK-Amino）和RPLC（不带Premier技术的ACQUITY UPLC CSH C18）。在使用乙腈或甲醇进行PPT时，RPLC均显示出比HILIC更小的基质效应。特别是在使用甲醇进行PPT时，从HILIC切换到RPLC将50 ng/mL维特拉生在大鼠血浆中的基质因子从55.5%改善到118%，将1000 ng/mL的基质因子从53.1%改善到113%。此外，为了探究维特拉生灵敏度降低的原因，进行了柱后灌注分析。在HILIC中，使用甲醇通过PPT制备的血浆样品在维特拉生保留时间（0.75 min）附近显示出明显的信号强度抑制，相比之下，使用乙腈制备的样品抑制较小。而在RPLC中，无论PPT使用的是乙腈还是甲醇，在维特拉生保留时间（1.16 min）附近的信号抑制都相对较小。这些结果表明，在HILIC中，使用甲醇PPT制备的大鼠血浆样品中共同流出的基质组分抑制了维特拉生的电离。相比之下，在RPLC中这种基质效应似乎最小。
通过使用减少分析物/表面相互作用的色谱柱改善吸附
为了改善维特拉生在色谱柱上的吸附，评估了具有减少分析物/表面相互作用功能的ACQUITY Premier CSH色谱柱，以避免维特拉生（1000 ng/mL）在色谱柱上的吸附。使用该色谱柱使维特拉生的峰面积比使用ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱增加了约1.6倍。
评估PPT与RPLC结合的分析方法性能
在浓度为10至2000 ng/mL的大鼠血浆维特拉生标准样品中测试了该样品前处理方法的线性。校准曲线和维特拉生及内标在LLOQ（10 ng/mL）处的代表性色谱图见Figure 4。校准曲线各点的回算值在相应标称浓度的95.0%至112%之间，决定系数为0.994。
在维特拉生的四个浓度（LLOQ：10 ng/mL、LQC：20 ng/mL、MQC：500 ng/mL、HQC：1600 ng/mL）下评估了批内准确度和精密度。结果显示，所有QC样品中维特拉生的批内准确度（运行1）在标称浓度的99.6%到112%之间，满足LLOQ ±20%和其他浓度±15%的标准。同样，所有QC样品中维特拉生的批内精密度在2.78%到8.63%之间，符合LLOQ ≤20%和其他浓度≤15%的标准。
通过离心蒸发仪提高灵敏度
为了通过样品浓缩建立更灵敏的生物分析方法，PPT后的样品使用离心蒸发仪干燥并用更小体积复溶。在浓度为1至200 ng/mL的大鼠血浆维特拉生标准样品中测试了该样品前处理方法的线性。校准曲线和维特拉生及内标在LLOQ（1 ng/mL）处的代表性色谱图见Figure 5。校准曲线各点的回算值在相应标称浓度的92.9%至114%之间，决定系数大于0.994。在LLOQ样品中，观察到分析物主峰附近有一个小的肩峰。然而，在空白样品色谱图的相应保留时间处未检测到峰，且在LLOQ以上的浓度样品中未观察到该肩峰。结果表明，该肩峰可能是测量条件的暂时性影响，而非基质组分或标准溶液杂质所致。
运行三个独立的批次以评估维特拉生在四个浓度（LLOQ：1 ng/mL、LQC：2 ng/mL、MQC：50 ng/mL、HQC：160 ng/mL）下的批内和批间准确度与精密度。结果显示，所有QC样品的批内准确度在标称浓度的95.5%到107%（LLOQ处为118%）之间，批间准确度在97.2%到111%之间，满足LLOQ ±20%和其他浓度±15%的标准。同样，所有QC样品的批内精密度在2.10%到14.0%之间，批间精密度在2.58%到10.3%之间，符合LLOQ ≤20%和其他浓度≤15%的标准。
在三次分析中检测到空白样品中维特拉生和内标的残留峰。空白样品中维特拉生和内标的峰面积分别占LLOQ处相应峰面积的0.423%到15.7%和0.0363%到0.0922%，符合验收标准。
改进的生物分析方法对不同序列PMO的适用性
为了评估该生物分析方法对不同PMO的适用性，我们研究了ψM23D (+07–18)的分析性能。在浓度为1至200 ng/mL的大鼠血浆ψM23D (+07–18)标准样品中测试了该样品前处理方法的线性。校准曲线和ψM23D (+07–18)及内标在LLOQ（1 ng/mL）处的代表性色谱图见Figure 6。校准曲线各点的回算值在相应标称浓度的90.1%至114%之间，决定系数为0.992。在LLOQ样品中观察到一个在1.62 min的峰。然而，在空白样品色谱图中也检测到类似的峰。由于该峰的强度在LLOQ以上的浓度样品中没有增加，因此不太可能源于基质组分或标准溶液中的杂质。因此，该峰被认为是背景信号或系统相关峰。
在四个浓度（LLOQ：1 ng/mL、LQC：2 ng/mL、MQC：50 ng/mL、HQC：160 ng/mL）下评估了批内准确度和精密度。结果显示，所有QC样品中ψM23D (+07–18)的批内准确度在标称浓度的98.0%到112%之间，满足LLOQ ±20%和其他浓度±15%的标准。同样，所有QC样品中ψM23D (+07–18)的批内精密度在1.54%到10.5%之间，符合LLOQ ≤20%和其他浓度≤15%的标准。
改进的生物分析方法对人血浆的适用性
为了评估该生物分析方法对不同基质的适用性，我们研究了其对人血浆的分析性能。在浓度为1至200 ng/mL的大鼠血浆维特拉生标准样品中测试了该样品前处理方法的线性。校准曲线和维特拉生及内标在LLOQ（1 ng/mL）处的代表性色谱图见Figure 7。校准曲线各点的回算值在相应标称浓度的96.3%至105%之间，决定系数为0.999。
在四个浓度（LLOQ：1 ng/mL、LQC：2 ng/mL、MQC：50 ng/mL、HQC：160 ng/mL）下评估了批内准确度和精密度。结果显示，所有QC样品中维特拉生的批内准确度在标称浓度的93.6%到104%之间，满足LLOQ ±20%和其他浓度±15%的标准。同样，所有QC样品中维特拉生的批内精密度在3.31%到4.44%之间，符合LLOQ ≤20%和其他浓度≤15%的标准。
讨论
开发稳健、高通量且高灵敏度的PMOs生物分析方法在药物发现和开发中非常重要。LC-MS/MS通常用于PMOs的生物分析；然而，在开发有用的生物分析方法时需要考虑几个方面。为此，本研究以典型PMO维特拉生为模型，研究了样品前处理方法和液相色谱条件，以建立一种简单且高灵敏度的生物分析方法。
使用甲醇进行PPT实现了维特拉生（50和1000 ng/mL）的高回收率（93.4%和102%），相比之下，乙腈的回收率较低（60.3%和58.5%）。此外，使用甲醇PPT对维特拉生的回收率高于其他PMOs通过SPE的回收率，如戈洛迪生（34.8–41.8%）、维特拉生（67.5–84.5%）和卡西默生（25.2–41.4%）。由于PPT简单、成本低且适用于多种分析物，因此是制备PMO样品的有用方法。然而，对于其他寡核苷酸如PS-ASO，已有报道称使用PPT进行样品前处理的回收率低或为零。PS-ASO回收率差的原因被认为是由于PS-ASO的高血浆蛋白结合率导致的共沉淀，例如诺西那生（nusinersen）在所有测试物种（小鼠、猴子和人类）中的结合率均大于94%。另一方面，已知PMOs的血浆蛋白结合率较低，例如维特拉生在所有测试物种（小鼠、大鼠、猴子和人类）中的结合率≤40%，这可能是PMOs回收率高的原因之一。
在先前的一项研究中，在SPE样品前处理后使用HILIC测量了维特拉生。然而，在本研究中，在相同条件下使用PPT进行样品前处理后，HILIC中分析物的响应由于基质效应而降低。已知PPT提取的样品与其他方法制备的样品相比相对粗糙，并且当应用于通过PPT提取的ASO时，分析的灵敏度据报道低于使用SPE或杂交提取的方法。此外，已知乙腈比甲醇具有更高的脱蛋白能力，这表明乙腈通过去除水合水能更好地沉淀各种生物物质。事实上，在HILIC中，使用乙腈获得的基质因子（73.8%和76.6%）优于使用甲醇获得的基质因子（55.5%和53.1%）。因此，可以认为分析物响应降低是由PPT样品的粗糙性引起的，并且使用甲醇沉淀需要良好的液相色谱分离以避免基质效应。
RPLC中的基质效应小于HILIC。PPT不能去除内源性化合物，例如磷脂，这些化合物在HILIC中在很宽的保留时间范围内被洗脱。柱后灌注（PCI）结果提示，离子抑制是由来源于基质的内源性化合物引起的。因此，认为从HILIC切换到RPLC减少了内源性化合物的离子抑制。此外，在本研究中，RPLC的每个样品分析时间（4 min）短于HILIC（5 min），因为HILIC色谱柱通常需要更长的平衡时间。因此，对于PMOs的定量分析，RPLC比HILIC更合适。综上所述，甲醇和乙腈之间存在一些差异。就回收率而言，甲醇优于乙腈；而就基质效应而言，乙腈优于甲醇。关于液相色谱，当样品用甲醇或乙腈制备时，RPLC能够避免基质效应。因此，我们采用甲醇作为PPT中的沉淀剂，并使用RPLC色谱柱进行PMOs的生物分析。
如上所述，我们采用了不使用离子对试剂的RPLC方法。IP-RPLC通常用于寡核苷酸的分析，特别是那些具有高阴离子骨架的寡核苷酸，如PS-ASO和siRNA，因为它能增强保留和分离。然而，PMOs具有中性骨架，因此IP-RPLC的优势在此背景下有限。此外，使用离子对试剂可能导致质谱灵敏度降低并使色谱柱维护复杂化。相比之下，本研究中使用的RPLC条件在不使用离子对试剂的情况下提供了足够的保留和分离，并且柱后灌注实验证实基质诱导的离子抑制最小。这些发现表明，对于如PMOs这样的中性寡核苷酸的分析，RPLC提供了一种比IP-RPLC更简单、更兼容质谱且更实用的替代方案。
如图所示，该方法对ψM23D (+07–18)（其碱基序列与维特拉生不同）表现出良好的线性、准确度和精密度，表明其适用于其他PMO序列。此外，如图所示，该方法在用人血浆的条件下也成功应用，表明基质差异的影响很小。这些发现表明，所开发的方法在不同PMO序列和生物基质中具有很高的通用性，为未来研究中的更广泛应用提供了稳健的基础。
已有广泛报道，在LC-MS/MS寡核苷酸分析中，对液相色谱系统中金属表面（如进样器、连接器、管路和色谱柱滤片）的非特异性吸附会导致峰拖尾、回收率低和残留。为了避免非特异性吸附，已经研究了几种技术，例如在流动相中使用牺牲寡核苷酸和不同的添加剂（乙酰丙酮、亚甲基二膦酸和柠檬酸盐）。另一种方法是使用金属游离材料，如聚醚醚酮来构建液相色谱柱。在ACQUITY Premier CSH色谱柱中，惰性混合表面技术应用于色谱柱滤片和壁的金属部件，这改善了对各种未修饰和修饰寡核苷酸的分析，例如PS、2′-O-甲基和2′-O-甲氧乙基修饰的寡核苷酸、锁核酸、DNA和RNA。在本研究中，也评估了ACQUITY Premier CSH色谱柱，与ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱相比，它显示出改善的维特拉生峰面积。这一结果表明ACQUITY Premier CSH色谱柱对于PMOs的分析是有用的。
尽管本研究中开发的生物分析方法在PMOs的定量方面表现出稳健的性能，但也应注意几个局限性。首先，使用小分子药物普萘洛尔作为内标。虽然使用维特拉生的结构类似物（如稳定同位素标记化合物）更可取，但维特拉生和普萘洛尔在本研究中均表现出良好的回收率和最小的基质效应，支持普萘洛尔作为内标的实际适用性。其次，目前的RPLC条件在分离具有与分析物相似理化性质的化合物方面存在局限性。事实上，维特拉生和ψM23D (+07–18)（它们在长度和碱基序列上均不同）在几乎相同的保留时间（分别为1.17 min和1.14 min）洗脱。这表明较短的杂质或代谢物也可能在当前的RPLC条件下与母体化合物共同洗脱。此外，该方法的适用性仅限于具有中性骨架和低血浆蛋白结合率的PMOs。像PS-ASOs这样表现出强负电荷和高蛋白结合率的寡核苷酸，在使用PPT处理时已知回收率会显著降低，因此该方法不适用于此类分子。最后，本研究使用加标分析物的大鼠和人血浆验证了该方法，并未包括实际生物样品的分析。尽管需要进一步使用体内样品进行评估以完全确立该方法的实用性，但该方法的原型已在另一项研究中成功应用于体内样品中维特拉生的分析，表明该方法适用于真实的生物样本。
包括维特拉生在内的各种PMO已被批准用于治疗杜氏肌营养不良症。我们先前已表明，PMO在肌肉（PMO的靶器官）中的浓度与其在血浆中的浓度之比对于预测人体中药效学标志物的变化是有用的。然而，使用LC-MS/MS定量PMOs的生物分析方法通常灵敏度不高。根据戈洛迪生、维特拉生和卡西默生的临床药理学和生物药剂学审评，血浆中的LLOQ为10至20 ng/mL。因此，由于PMOs在血浆中快速下降，其在后期时间点的血浆浓度无法测定，这使得难以获得稳态下的Kp。在本研究中，我们为维特拉生建立了一种更灵敏的生物分析方法（LLOQ：1 ng/mL）。在我们先前对维特拉生药代动力学的研究中，使用了本研究中建立的方法原型。在每周一次给药方案的最
