《Bioanalysis》：Implementation of the fully automated diagnostic immunoanalyzer cobas e411 in the bioanalytical laboratory - Lessons learnt
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这篇综述探讨了将临床诊断用的全自动免疫分析仪cobas e411改造并应用于（GLP）规范下生物分析实验室的完整历程。文章系统评估了其相较于传统手动ELISA，在自动化、宽动态范围、多分析物检测及合规性等方面的显著优势，并介绍了为实现GLP合规（如FDA 21 CFR Part 11）所开发的定制化软件系统（Elecsys系统）。研究证实，该平台能显著提升数据质量与效率，缩短（TAT），并为（PK）/（PD）分析提供新范式。
在生物治疗药物的临床前和临床开发过程中，药物动力学（PK）、药效学（PD）和安全性的表征至关重要。数十年来，配体结合测定（LBA）因其优异的分析灵敏度、特异性和选择性，一直是生物治疗药物、多肽、可溶性药物靶点、生物标志物和抗药物抗体生物分析的金标准。其中最常用的LBA形式是酶联免疫吸附测定（ELISA），通常采用基于微孔板的夹心法形式，以比色吸光度或电化学发光（ECL）等技术进行检测。然而，传统手动ELISA流程劳动密集、耗时费力，且易引入分析人员个体差异和人为错误。其通量相对较低，动态范围有限（通常≤3个数量级），这对于分析物浓度变化范围大的研究（如毒理学和早期临床试验）以及样本量巨大的后期临床试验构成了显著挑战。
本研究评估了全自动诊断免疫分析仪cobas e411（罗氏诊断）作为手动ELISA的高效替代方案，用于PK和PD分析的潜力。该平台基于经典的夹心法原理，使用生物素化捕获试剂和钌标记检测试剂，并结合电化学发光（ECL）检测技术。为了使其符合良好实验室规范（GLP）和FDA 21 CFR Part 11及Part 58等法规要求，研究团队构建了一个名为“Elecsys系统”的专用平台。该系统由现成的cobas e411硬件和一个内部开发的软件包“CoLiBri”组成，后者用于仪器控制和连接实验室信息管理系统（LIMS），并经过了计算机化系统验证（CSV）。
动态范围与分析灵敏度
研究首先评估了平台的动态范围。以单次静脉给药后63天内食蟹猴血清中单克隆抗体mAb-1的分析为例，cobas e411上建立的LBA方法，其定量下限（LLOQ）为0.69 ng/mL，动态范围跨越3.3个log10浓度范围（0.69 ng/mL至1500 ng/mL），使得所有血清样本仅需两种预稀释（1:10和1:400）即可完成分析。相比之下，使用动态范围仅2.1个log10（4.0 ng/mL至500 ng/mL）的ELISA平台分析相同样本，则需要至少三种不同的样本稀释因子，耗时且增加手动操作。
增强的自动化与更快的周转时间
cobas e411采用完全自动化的液相结合测定流程，包含两个孵育步骤，采用序列分析模式。与基于微孔板的并行分析LBA相比，其将分析人员的手动操作时间大幅减少，仅限于运行前的试剂准备、样本加载/预稀释和仪器设置。以一个包含100个样本（7个校准品、1个空白、6个质控品和86个未知样本）的双复孔分析为例，总测定时间约为2.6小时。而使用顺序ELISA分析相同数量的未知样本，总测定时间约为5.5小时。若采用单次分析，cobas e411和手动ELISA的时间分别为1.5小时和5.0小时，效率提升显著。这种自动化减少了人为错误，但因其序列工作流程，质量控制概念需要调整，采用类似色谱法的质控样本“前后包围”策略来确保未知样本分析的可靠性。
多分析物分析能力
cobas e411能够从单个样本中并行执行多达18种不同分析物的检测。这在生物分析实验室中提供了同时获取多种数据（如PK和生物标志物PD数据）的机会。在计算机化系统验证期间，已实验证明可从单个样本中同时分析多达五种分析物。一个实际应用案例是同时检测治疗性抗体候选物mAb-2的靶点结合能力和总水平，揭示了药物结合效力随时间推移而逐渐下降的动态过程，这有助于在药物开发阶段设计具有良好体内PK特性的稳定候选药物。
Elecsys系统：解锁cobas e411用于GLP环境
cobas e411作为临床分析仪，其设计符合体外诊断医疗器械指令（IVDD/IVDR）、ISO 13485等临床实验室法规，但最初并不完全满足GLP环境对数据质量、文档和完整性的特定要求。主要挑战包括：电子记录管理、审计追踪和用户访问控制未完全达到FDA 21 CFR Part 11要求；缺乏支持其在GLP环境中使用的验证文件；其校准概念（最多支持5个校准品）不满足ICH M10指南要求的至少6个非零校准品；以及缺乏与生物分析LIMS系统的直接连接性。为解决这些问题，团队开发了Elecsys系统，其核心是CoLiBri软件。该软件提供了完全符合GLP要求的用户账户管理、全面的审计追踪功能、自动化仪器控制以及双向样本和数据交换能力。通过对Elecsys系统进行前瞻性、基于风险的计算机化系统验证，使其能够完全符合OECD、FDA和EMA（包括FDA 21 CFR Part 11和58）的法规要求，并支持使用无限数量校准品的灵活校准模型，满足ICH M10要求。
Elecsys系统分析工作流程
分析运行在Watson LIMS中计划，生成工作列表文件并导入CoLiBri，转换为加载指令文件。cobas e411根据此文件信息完全自主运行。有两种使用模式：1）自主测定执行：单个运行最多可分析100个样本（单稀释因子），实现完全自动化、“无人值守”操作。2）交互式测定执行：单个运行最多可分析360个样本（单稀释因子），但运行期间需要分析人员补充耗材（吸头、反应管）。自主运行模式是首选，因其允许分析人员在运行期间准备下一次运行所需物品，每天可轻松进行三次分析运行，分析多达258个样本。
临床PK方法验证：ELISA与Elecsys性能比较（双复孔分析）
为定量人血清中的mAb-3，分别建立了ELISA和Elecsys两种分析方法（均采用双复孔）。尽管使用相同的生物素化抗独特型捕获抗体和抗融合蛋白检测抗体（ELISA用地高辛标记，Elecsys用钌标记），但测定方案不同：ELISA采用顺序方案，而Elecsys采用同时孵育方案。两种方法均经过全面验证，符合ICH M10指南要求。比较发现，两种平台均表现出良好且可比的分析精密度，平均测定信号精密度分别为≤2.1% CV和1.8% CV。两种方法均具有极高的灵敏度，ELISA的LLOQ为78.1 pg/mL，Elecsys为49.4 pg/mL。Elecsys方法在提供可比精密度和准确度的同时，其校准范围（4个数量级）显著宽于传统比色ELISA（1.8个数量级）。Elecsys的宽动态范围允许在单个分析运行内分析更广浓度范围的未知样本，减少了多次样本稀释和重新分析的需要。虽然Elecsys系统也存在携带污染和钩状效应等潜在缺点，但在方法验证中进行了评估和缓解。
临床PK样本分析：ELISA与Elecsys性能比较（双复孔分析）
对临床I期试验中收集的521份人血清样本进行mAb-3浓度检测，分别用ELISA（34次运行）和Elecsys系统（13次运行）进行双复孔分析。两个平台的分析运行通过率均高于90%。由于Elecsys方法的动态范围更宽，所有临床样本均可在相同的稀释因子（5倍）下进行分析，无需进一步稀释。对两种平台均有数值结果的351份临床样本进行可比性评估，85.8%的样本结果差异在±30%以内，表明平台间具有良好的可比性。Bland-Altman图分析显示，观察到的平台偏差在整个浓度范围内并非恒定，在低浓度（<0.3 ng/mL）时多为负偏差，在高浓度（>1 ng/mL）时呈现约16%的系统性正偏差。这种差异可能归因于不同实验室制备校准品和质控品时分析人员依赖的变异性，以及两种平台不同测定方案和孵育时间的影响。Elecsys系统短暂的孵育时间（4.5分钟）使其特别适合定量游离（未结合）药物分数。
释放全自动LBA的潜力：Elecsys系统的单次分析
与ELISA不同，在全自动LBA平台上进行单次分析提供了将通量翻倍、并将周转时间、样本体积、关键试剂和耗材消耗减半的可能性，同时保持较高的数据质量和测定成功率。为评估Elecsys系统是否能完全实现这些效率增益，研究对使用双复孔方法生成的临床样本数据集进行了重新评估，通过停用所有校准品、质控品和研究样本的第二个复孔数据来模拟单次分析。结果表明，双复孔分析的精密度极佳（平均CV为1.1%），且两种评估方法的分析运行通过率相同。校准品和质控品的方法性能数据具有可比性。在369份至少有一个数值结果的临床样本中，363份样本在单次和双次分析中均产生数值，其中99.7%的样本百分比差异≤30%。Bland-Altman图显示，单次分析与双次分析之间的平均百分比差异极低，偏差仅为-0.4%，凸显了两种方法令人印象深刻的精密度。这些数据证明，Elecsys测定即使采用单次分析方法也能产生足够质量的数据，这符合ICH M10的描述，并支持在受监管的生物分析中逐步推广单次分析方法。
结论与未来展望
研究结果清晰地表明，将全自动诊断免疫分析仪整合到生物分析PK/PD分析中，是提高生物分析实验室质量、时间线和投资回报率的重要进步。cobas e411平台的自动化样本处理和标准化分析流程能产生高度可重复的数据和较高的整体数据质量，同时减少甚至消除了手动操作中观察到的人为错误。其分析性能很好地符合药代动力学生物分析测定的要求，并提供了诸如宽动态范围（标准比色ELISA通常不具备）、多分析物分析潜力等优势。短暂的孵育时间和最少的样本稀释很重要，但像cobas e411这样能够在分析前对每个样本进行单独稀释的能力，对于通过保持一致的样本历史和避免复杂的解离来实现准确的游离分析物定量至关重要。采用cobas e411等临床分析仪的全自动化，为生物分析实验室带来了诸多好处：利用诊断领域数十年来积累的液体处理和测定自动化经验；消除人为错误，提高测定成功率；与单次分析结合，相比传统的基于微孔板的测定，可将通量翻倍，减少基质体积、关键试剂消耗和周转时间；促进测定在内部和外部供应商（CRO）之间的快速转移、验证和全球实施，从而显著节约成本；将周转时间缩短一半，支持更快的药物开发；在不同实验室使用相同的仪器和流程有利于交叉验证并提高成功率。
然而，诊断平台在生物分析环境中的应用面临一大挑战，即诊断应用与GLP合规性要求的差异。尽管指南对仪器和软件验证、文档和数据质量的要求有重叠之处，但在GLP环境中将诊断仪器用于生物分析目的需要进行多项调整，在本研究中，这只能通过实施用于LIMS连接的接口软件和计算机化系统验证来解决。
未来，在生物分析实验室中更广泛地实施诊断流程可带来显著的分析和程序改进，从而实现更快、更高质量和更具成本效益的临床前和临床生物分析。单次分析在受监管生物分析中的应用就是一个典型例子。另一个主要差异在于校准概念：虽然电子主校准曲线和两点校准等概念在诊断中广泛实施并已验证其适用性，但ICH M10仍规定每次分析运行需进行传统的六点校准，这阻碍了现成诊断分析仪在受监管生物分析实验室中的实施。协调体外诊断和良好实验室规范指南之间的分析和程序要求，将使生物分析实验室能够使用此类分析平台，最好是与“自配”定制测定开发试剂盒结合使用，类似于已在受监管生物分析中常用平台上的做法，从而能够使用其试剂建立专有的PK/PD测定。
